Бинарная стратегия Estrella

Рейтинг честных брокеров бинарных опционов за 2020 год:
  • Бинариум
    Бинариум

    Лидер на рынке! Надежный брокер бинарных опционов, идеальный для новичков! Даёт большой бонус за регистрацию:

Дартстрэйд

Биржевая торговля, финансовые рынки, трейдинг

Фотографии

События

Аналитика

Прямой эфир

Блоги

  • Творилка5.68
  • Дивитикерка5.03
  • Оба на!4.52
  • Переводка3.68
  • HELP-ME QUICKLY2.29
  • Чирикалка Новых новостей2.26
  • Гурилка2.26
  • Летописка1.13
  • Идеоттилка1.13
  • Блог Администратора1.13
  • Мы приносим свои извинения, но в данный момент наш сайт конфликтует с Microsoft Internet Explorer. Пожалуйста, используйте другой браузер.
  • Интересные
  • Новые+1
  • Обсуждаемые
  • TOP

Как зафиксировать лося.

Увы, сделать этом можно. Но очень печально.
В пятницу случай был не на моей стороне, и пришлось уходить от лобового столкновения.
Здоровый лось перебегал дорогу — быстро появился из темноты и там бы исчез, если бы не мое транспортное средство.

Мне повезло, лосю нет — егеря в итоге его дострелили.
Мораль — настраивайте яндекс-навигатор не на короткий и быстрый пусть, а на главные дороги.

по рынку — вью то-же — началась откачка ликвидности с периферии…

Достать баян и плакать.

Скучный день.
Ни тебе календарных палиндромов, ни дня сурка, кривой понедельник и продолжающееся шоу из Китая.
Хоть рынки у них открылись. Но могли бы и не открывать — смысл?
И, кстати, так и до Омерики дойдет, что пора валить… Вопрос, куда? В трежерис и золото. НО, золото сегодня не очень, нефть не падает, так что раздачи не предвидится.

Приятно потыкать.
Да и Амарок с нами!

Веселые картинки

правда, и Омерика вчера под закрытие (аяговорила!) нарисовала какое-то свиноподобное падение. Мысль такова — впереди год, предвыборный, вирус косит, дефицит бюджета, как после войны, фрс мнется, весь позитив в ценах с перехлестом — энтузиастов в последнее время кто только не стимулировал потратить бабло — и Оппенгеймеры, и тот перец с присказкос кэш-трэш, и отчеты Амазона-Эппла и т.п.
Так что денег нет, но и держаться не на чем…
и вишенка на торте:

Василий Олейник
18 мин. ·
Америка с воскресения вводит режим ЧС в стране. Указ подписал Д.Трамп. Но об этом сообщили после закрытия рынка, потому что сначала должны выйти из акций свои, потом все остальные. А как перед этим, в четверг, в последний час торгов, всех развели? Ну не твари? Я тоже попал и закрыл часть шортов. Российскому рынку тоже падать ещё не менее 10%, он кстати на месяцах нарисовал идеальный разворот по РТС.

Тикайте, хлопцы. Айл би бэк!

Омерика еще подергается — там феерия очередная… Богатые богатеют, бедные беднеют.
Думаю, с периферии начнется отток денег — как ни крути, глобализация уходит, а с ней вместе и глобальные деньги. Уходят на родину… С учетом планируемого дефицита бюджета Омерики, пылесосить деньги будут знатно — вряд ли ФРС потянет закрыть все дыры.
А тут еще это Грета…

Рейтинг русскоязычных брокеров бинарных опционов 2020:
  • Бинариум
    Бинариум

    Лидер на рынке! Надежный брокер бинарных опционов, идеальный для новичков! Даёт большой бонус за регистрацию:

Приятно потыкать. Амарок с нами!

Коронный номер Китая.

Китай поломал рынки. Вопрос — надолго ли?
То, что у Поднебесной теперь есть все возможности под форс-мажор девальвировать юань — к бабке не ходи.

То, как кучно пошли в трежерис и золото, показывает, что быстро не уляжется.
Интересно будет закрытие Омерики — если опять будет красным, то, скорее всего, это тенденция. Осталось посмотреть, что будет делать ФРС — даст выпустить пар или зальет деньгами, как обычно.

ПРиятно потыкать!
Да и Амарок!

Можно потихоньку втягиваться в работу )))

Вот и восточный Новый год отгуляли (кто знал и хотел), да ещё и этот Илон Маск опять за неделю на два ярда стал богаче

Экологически трендим.

Как и ожидалось, (кхе-кхе) Давос таки выпустил Грету на подиум. Экология рулит!

Тон задан — сворачивать нах все углеводороды. Прямо сейчас. Всем — по велосипеду и крутить педали домой. Американцам повезло меньше всех — на парусниках через Атлантику зимой и Конюхов, полагаю, не рискнет…
ну, да ладно.
В рамках тренда оч. круто ложится мой рутек, ибо снижает ресурсопотребление на 5-12% как с куста. В мировом масштабе это создаст дефицит углекислого газа, что тоже не айс, если честно.

Приятно потыкать. Да и Амарок!

Итоги 2020.

Парадигма вечного роста.

Да. Рынок будет расти всегда. Главный вопрос не в том, будут ли на это деньги — деньги будут.

Главные вопросы (их два) — 1. можно ли будет продать те активы, которые растут? 2. если можно, то что на вырученные деньги можно будет купить?
Т.е. дилемма будет или в невозможности вытащить деньги без потерь или в невозможности их потратить ввиду низкой покупательной способности.
Чудес не бывает, увы. Если где-то прибыло, то где-то убыло. Квантовый финансовый рынок со своими законами, оторванными от законов физики, существовать может, но недолго. Сила земного притяжения — матьее — по-любому будет. И чем выше, тем большее.

Реферат: Регистрация сигнальных молекул

1. обзор литературы

1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии

1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens

1.1.2. Cоздание векторов на основе Ti-плазмид

1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке

и ее перенос в клетки растений

1.1.4. Разработка система трансформаций растений с

помощью Agrobacterium tumefaciens

1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов,

перенесенных в растение

1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях

1.2. Использование метода генетической

инженерии для трансформации однодольных растений

1.2.1. Краткие характеристики ряски

1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК

2. Материалы и методы

2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.4. Среды микробиологические для

2.1.5. Другие растворы

2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии

2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с

экссудатами тканей растений

2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens

2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну

2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli

НУК – нафтиуксусная кислота

Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий опухоль). В процессе идентифицирования растений часть генетического материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая) перемещается в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь частью наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в трансформарованных растительных клетках, нарушают их фитогормональный баланс и определяют синтез специфических ——- соединений.

Таким образом, агробактерии являются природными «генными инженерами», осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос генетической информации. На основе агробактерий сконструированы эффективные векторные системы для генетической инженерии растений.

Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса взаимодействия между бактериальными и растительными клетками. В этом процессе одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особых сигнальных молекул, присутствующих в экссудатах поврежденных тканей растений. Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir (агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ее перенос в клетки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь у весьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин ограничений агробактериальной трансформации однодольных считается присутствие в их клетках сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и перенос тДНК.

В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул, индуцирующих процессинг тДНК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии растений

1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens

За последнее десятилетие в области генетической инженерии растений достигнуты значительные успехи. Были разработаны разнообразные методы генетической трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессия чужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее важным для развития генетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых образований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7].

Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) характеризуются присутствием в клетках большой плазмиды, так называемой Ti-плазмиды, весом более 150 т.п.н. (см. Приложение) [9].

Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo необходимо повреждение тканей растения [12].

После прикрепления к клеточной стенке растительной клетки агробактерии переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро, где происходит ее стабильная интеграция в хромосому растения.

Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления к ним, а так же вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительный геном кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-области, находящихся на Ti-плазмиде [14].

После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может интегрировать в геном в виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства, характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-плазмиды, в тДНК находится от семи до тринадцати генов, ответственных за опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5′-монофосфат [16].

Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышению уровня фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этого является повышение митотической активности и образование опухоли. Другие гены тДНК кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапин и октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров, которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом, образование корончатого галла представляет собой хорошо охарактеризованный пример генетической инженерии растений в природе.

Мутации в вирулентных генах агробактерий . Наличие Ti-плазмид в клетках агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны. На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируются конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического b-D-гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального b-D-гликана в инфекционном процессе еще точно не установлена. Помимо циклического b-D-гликана в прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.

Организация vir- генов Ti-плазмид . Вирулентные гены агробактерий на Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb, проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами конъюгитивных плазмид. В —— Ti-плазмидах в области vir локализовано шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas et al., 1984]. Мутации в генах и ——— vir A, vir G, vir B и vir D придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.

Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов «вырезания» тДНК из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК размером 24 —- , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.

Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же как и на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.

На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутации в генах vir B и vir D – оперонов.

1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид

В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести чужеродные последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], либо путем сайт-специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с Ti-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981]. Однако, эти ранние эксперименты, основанные на двойной рекомбинации, занимали много времени, были довольно сложны и трансформации проходили с очень низкой частотой. Необходимо было разработать более эффективные векторы, чтобы облегчить генетические манипуляции с бактериями и позволить селекцию и регенерацию трансформатов.

Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных генов в растения с помощью Ti-плазмид:

2. бинарные векторы.

В основе создания ——— векторов лежит тот факт, что гены тДНК не ——- для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В ——— векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность pBR322, а чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения, нужно проклонировать в этом же векторе.

Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.

ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ——- области тДНК pGV3850 с любыми производыми pBR, несущими клонированный ген.

Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных растений, были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322 из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В настоящее время сконструированы и успешно используются и другие — ———- векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].

Схемы ——— (А) и бинарной (Б) векторных систем. vir – область вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых может происходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB – левая и правая границы тДНК. MCS — —— сайт для клонирования. РТМ – маркет трансформации для растений. RES – маркер устойчивости к антибиотику для бактерий. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало репликации из плазмиды широкого круга хозяев RK2.

Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir могут распологаться на разных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких системах обычно присутствуют два элемента:

1) Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида несет в своем составе гены vir, действующие in trans.

2) Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис

Обе описанные выше системы векторов предполагают ——— этапах сборку нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena, Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий.

1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке

и ее перенос в клетки растений

Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens с механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами или в присутствии ——— из клеток бактерий можно выделить различные молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные, двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут претендовать на роль посредника в переносе генетического материала в растительную клетку [——-, 1980]. Причем кольцевая форма, образующаяся за счет гомологичной рекомбинации между правой и левой границей тДНК с образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в то время как в случае образования двух других форм, возможно прохождение репликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к появлению одноцепочечных форм может приводить прерывание, ингибирование прерывистого синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить сохранение тДНК в исходной Ti-плазмиде, если только не допустить возможность существования физического вырезания материала тДНК из Ti-плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах. Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главным недостатком отошедшей на второй план подобной «эксцезионной модели». Тем не менее, образование двуцепочечных разрывов внутри границ и появление детектируемых количеств линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании бактериальных клеток в присутствии ———- исследователи наблюдали уже через 30 минут после добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов ——— в клетках агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].

Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после добавления индуктора, и его количество накапливается на протяжении последующих 40 часов более, чем в два раза, а затем идет на убыль, показывая, что процесс лимитирован.

Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную клетку до сих пор остается не выясненным из-за трудности определения относительного количества каждой из форм и выявления динамики их превращения. Возможно, процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени и идут сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид, происходящему в месте контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда все обнаруживаемые интермедиаты могут быть аберрантными формами прерванного на каком-то этапе неделимого процесса (или неправильно завершенного). В случае индуцированной экспрессии vir-генов ——- отсутствует главный элемент взаимодействия – контакт бактериальной клетки и растительной клетки, и, поэтому, все обнаруживаемые в этом случае формы могут претендовать на роль посредника лишь с определенными допущениями. Достоверно известно, что в растительную клетку попадает только одна цепь тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже в растительной клетке. Обсуждается, что в случае прохождения в клетке Agrobacterium tumefaciens ——— полуконсервативной репликации тДНК вторая цепь может в процессе переноса гидролизоваться, высвобождая энергию для транспорта переносимой цепи.

1.1.4. Разработка система трансформаций растений с

помощью Agrobacterium tumefaciens

Большинство первоначальных экспериметнов по генетической трансформации растений было предпринято с помощью заражения пораненных растительных клеток с помощью агробактерий с немодифицированными Ti-плазмидами. Для сохранения стерильности часто инфицировали эксплантаты in vitro вместо целых растений. Бактерии затем удаляли, добавляли в среду цефотоксин или карбенициллин. Трансформанты отбирали на безгормональной среде.

В дальнейшем по мере создания обезоруженных векторов и новых селективных маркеров, был разработан более эффективный метод, дающий большое число трансформантов: кокультивирование агробактерий с растительными протопластами либо с эксплантантами листьев. Было показано, что кокультивирование протопластов с агробактериями, либо с бактериальными ———, приводит к образованию опухоли [Marton et al., 1979, Wullems et al., 1981]. Затем подобный подход был успешно применен для трансформации растительных клеток агробактериями, несущими в составе тДНК химерные селективные маркеры [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].

Этот метод был в дальнейшем улучшен использованием так называемых фидерных культур [Fraley et al., 1983]. Однако, все перечисленные методы пригодны только для трансформации растений, которые можно легко регенерировать из протопластов (например, табак и петуния). Эту проблему мрожно легко преодолеть кокультивируя агробактерии с листовыми дисками вместо протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986]. Стерильные листовые диски ——— с агробактериями, несущими в составе обезоруженного вектора какой-либо селективный маркер устойчивости к антибиотику. Затем кусочки листьев культивируют два дня на фидерных чашках со средой для образования побегов. После этого их переносят на среду с цефотоксином для уничтожения бактерий и с каким-либо антибиотиком (например, с ———) для отбора трансформантов. Регенерировавшие побеги дают корни, после чего растения переносят в почву для проведения дальнейших экспериментов.

Поскольку метод трансформации листовых дисков представляет собой идеальное сочетание высокой частоты трансформации с легкой и быстрой ——- и регенерацией трансформантов, этот подход стали использовать во многих лабораториях мира. Кроме того были предложены некоторые модификации метода. Для повышения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было предложено обрабатывать агробактерии ——— [Sheikholeskam a. Week S, 1987], который является индуктором генов vir [Stachel et al., 1985]. Однако метод трансформации листовых дисков применим для трансформации только тех видов растений, которые могут регенерировать побеги из недифференцированных клеток в месте поранения.

Наряду с методом трансформации листовых дисков широко используются конъюгированные агробактерии со стеблевыми сегментами [An et al., 1986], клетками суспензированной культуры [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами [Pollock et al, 1985] и прорастающими семенами [Feldmam a. Markis, 1987]. Метод трансформации семян агробактериями был впервые применен для арабидопсиса и заслуживает особого внимания, так как не требует работы с культурой ткани.

1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение

Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клетки с помощью различных методов, обычно встраиваются в ядерный геном и наследуются в соответствии с законами Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Области ингерации, по видимому, распределены случайным образом по геному. Встраивание генов по определенным сайтам было ранее описано в системах животных клеток [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] и недавно подобный подход был успешно применен для трансформации растений [Paszkowski et al., 1988].

В большинстве случаев последовательности чужеродной ДНК встраиваются в один локус либо в одной копии, либо в виде кластера тандемных вставок, что было показано с помощью гибридизации in situ [Mouras et al., 1986]. Однако, часто наблюдаются множественные вставки в два или более участков на разных хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a. Marus, 1987]. В связи с этим во многих случах была получена контрансформация физически несцепленных генов, сегрегация некоторых проходила в поколении F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].

Чужеродыне гены обычно передаются потомству с высокой степенью стабильности при мейозе [Muller et al., 1987]. Однако, иногда наблюдали случайную потерю трансформированного фенотипа после мейоза [Potrykus et al., 1989].

Возмножно, это происходило из-за активации чужеродного гена (например, при метилировании ДНК). Интеграция чужеродной ДНК во внеядерные геномы, например, в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], так же происходит по неменделевскому типу наследования – по материнской линии.

Используя метод гибридизации по Саузерну [Southern, 1975] для анализа трансформантов и их потомства, многие исследователи показали, что часто наблюдается встраивание укороченных, тандемных или перестроенных копий чужеродных генов, особенно после прямого переноса ДНК в протопласты [Krens et al., 1985]. Появление тандемов, часто от 5 до 20 копий, можно объяснить рядом рекомбинаций перед интеграцией в геном [Szernilofsky et al., 1986; Wirtz et al., 1987]. Образование инвертированных повторов является основным типом перестроек чужеродной ДНК при применении векторов, содержащих тДНК —— Ti-плазмиды [Jorgensen et al., 1987].

Итак, при проведении опытов по трансформации растений, необходимо принимать во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться различным модификациям перед встраиванием в геном хозяина. Однако, и после интеграции могут происходить различные ее перестройки, обычно во время мейоза [Czernilofsky et al., 1986]. В таких случаях только перекрестное опыление тщательно отобранных трансформантов с наиболее желаемым генотипом и фенотипом дает потомство с предсказуемыми призанаками.

1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях

Для качественного и количественного анализа экспрессии чужеродных генов в растениях используют множество методов, включая Нозери-анализ РНК [Nagy et al., 1988] и Вестери-анализ продуктов трансдукции [Burnette, 1981]. Кроме того, изучают фенотипические признаки такие как, устойчивость к антибиотикам и гербицидам. Для анализа экспрессии таких репортерных генов, как cat, npt II, гены октопин- и ——— разработаны чувствительные методы [Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].

Такого рода анализ может иметь большое значение, поскольку можно комбинировать кодирующие последовательности репортерных генов с подходящими регуляторными последовательностями растительных генов, либо создавать двойные гены, экспрессирующиеся с одного и того же промотора. Активность гена и промотора можно таким образом определить либо с помощью ферментативного анализа, либо гибридизацией растительной РНК с зондами, комплементарными репортерному гену.

Перечисленные выше разнообразные методики можно успешно применять для анализа экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях, в частности, генов устойчивости к гербицидам, насекомым, облучению, антибиотикам и др.

1.2. Использование метода генетической

инженерии для трансформации однодольных растений

1.2.1. Краткие характеристики ряски

Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родов и 30 видов, встречающихся на всех континентах. Наиболее широко они распространены в Северной и Южной Америке, Африке, Австралии. Представители семейства рясковые являются самыми маленькими в мире цветковыми растениями, венчики которых редко превышают 1 см. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции всех своих органов, поэтому и по простоте строения занимают первое место среди цветковых.

Рясковые – водные, свободноплавающие, большей частью многолетние травянистые растения. По своей природе рясковые являются неотеническими формами произошедшими от предков современного водоплавающего рода Пистия из семейства Ароидных . Рясковые служат кормом для диких и домашних уток, а так же других водоплавающих и болотных птиц, для рыб, особенно карпа, и ондатры. В сельском хозяйстве их используют в свежем и сушеном виде как ценный белковый корм для свиней и домашней птицы. Применяются рясковые и для очистки воды, так как извлекают из нее и запасают в своих листьях азот, фосфор, калий, а так же поглощиют углекислый газ и обогащают воду кислородом. Употребляются и человеком.

За последние 50 лет рясковые рассматриваются, как чрезвычайно ценный экспериментальный объект для морфогенетических, физиологических и биохимических исследований благодаря неприхотливости к среде, малым размерам, быстрому росту, что позволяет использовать всего один генетический клон на протяжении всего эксперимента.

1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК

Экспрессию генов vir-области индуцируют специфические сигнальные молекулы посредством позитивной регуляции системы в состав которой входят гены virA и virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].

Активаторами транскрипции vir-генов являются низкомолекулярные моноциклические фенольные соединения, синтезируемые в механически поврежденных тканях растений [Stuchel, 1985]. Примерами таких соединений являются ———— и довольно широкий круг производных ——- биосинтетического пути метаболитов защитной природы или предшественников лигнина.

Сигнальные молекулы были впервые обнаружены в экссудатах корней и листьев двудольного растения Nicotiano tabacum, они были идентифицированы как —— и ——-. Эти соединения синтезировали метаболически активные поврежденные ткани растений. В настоящее время установлена сигнальная индуцирующая активность у большой группы ——- соединений растительной природы. Механическое повреждение тканей растений приводит к усилению синтеза таких сигнальных соединений. Известно, что ———— и коричная кислоты, проявляющие сигнальную активность, обладают так же антимикробными свойствами и являются промежуточными метаболитами на пути синтеза ——-. ———- распознаются специфическими рецепторами агробактерий, являющимися трансмембранными хеморецептргыми белками с различной ——- к таким молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальной индукции экспрессии генов vir требуется присутствие в эксцудатах растений различных углеводов: глюкозы, глюкуроновой кислоты, галактозы, галактуроновой кислоты, арабинозы, маннозы, фукозы, целлобиозы и ксилозы, представляющих компоненты клеточной стенки растений. Такие углеводы связываются с периплазматическим доменом рецептора в виде предварительно обработанного комплекса с белком-продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причем конечный результат индукции процессинга тДНК зависит от синергической активности сигнальных соединений и сахаров эксцудатов растений.

Позитивная регуляторная система vir A – vir G, контролирующая экспрессию генов vir ——, работает следующим образом. Экспрессируемый конститутивно ген vir A выполняет функцию рецепции сигнальных молекул растений и трансмиссии этого сигнала в бактериальную клетку. Этот мембранный хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена vir G, который в свою очередь выступает в качетве позитивного регулятора собственной транскрипции и транскрипции остальных генов vir ——. Механизмы активации следующие.

Белок vir A, дважды пронизывающий мембрану бактерии, при появлении сигнальных молекул автофосфорилируется ——— на своем С-конце, переходя в активную форму. (В отсутствии индукции С-терминальный домен белки vir A взаимодействуют с W-терминальным доменом, ингибируя киназную активность).

Активированный белок vir A в свою очередь ——— внутренний клеточный белок – трансдуктор сигнала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al., 1990]. Фосфорилированный белок vir G связывается с промоторами остальных генов регулона и со своим собственным, выступая в качестве транскрипционного активатора. Индукция vir генов обратимая, и каскад реакций может быть прерван, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин больной и нежизнеспособный организм, перенос тДНК в его клетки не осуществляется [Hess et al., 1991].

Кроме позитивной регуляторной системы vir A – vir G, локализованной на Ti-плазмиде, в регуляции экспрессии vir-генов принимают участие также хромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного хромосомного мутанта ros, у которого гены vir C и vir D – оперонов экспрессируются в отсутствие сигнальных молекул растений.

3. Материалы и методы

Копалка, термомиксер 5436, центрифуга «Эппиндорф», прибор для горизонтального электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.

Бинарная стратегия Estrella

На правах рукописи

БАЙМИЕВ АНДРЕЙ ХАНИФОВИЧ

КЛУБЕНЬКОВЫЕ БАКТЕРИИ ДИКОРАСТУЩИХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ ЮЖНОГО УРАЛА И МОЛЕКУЛЯРНОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ ИХ ИСКУССТВЕННЫХ АССОЦИАЦИЙ С НЕБОБОВЫМИ РАСТЕНИЯМИ

03.01.03 — молекулярная биология 03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович

доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна

доктор биологических наук, профессор Антонюк Людмила Петровна

доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашифовна

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Защита состоится /6 марта 2020 г. в // часов

на заседании Объединенного Диссертационного совета Д 002.133.01 при Учреждении Российской Академии наук Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), С авторефератом — на сайте ВАК РФ и на сайте ИБГ УНЦ РАН ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: [email protected]

Автореферат разослан » » февраля 2020 г.

Ученый секретарь ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клубеньковые бактерии (ризобии) — обширная, генетически разнородная группа почвенных грамотрицательных микроорганизмов, способных вступать во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и обеспечивать фиксацию атмосферного азота.

Интерес к этим бактериям со стороны исследователей связан, с одной стороны, сельскохозяйственной значимостью симбиотической азотфиксации и необходимостью разработки генетических методов селекции и конструирования хозяйственно-ценных штаммов ризобий, инокуляция которыми позволяет получать высокие урожаи бобовых культур без использования дорогостоящих и экологически небезопасных азотных удобрений (Симаров, 1990), а с другой — использованием ризобий как модельного объекта для изучения биологии взаимодействия микроорганизмов с высшими растениями, генетического контроля и эволюции сим биотических систем (Онищук, 1995).

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является исследование генетических ресурсов клубеньковых бактерий, особенно естественных природных популяций, где наиболее эффективным подходом для этих исследований является анализ их генетического разнообразия, результатом которого может быть понимание процессов возникновения новых генотипов за счет мутаций, рекомбинаций, горизонтального переноса генов. В настоящее время для характеристики ризобий широко используются различные молекулярно-генетические методы. Преимущество этих методов состоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики, независящие от физиологического статуса микроорганизма.

Значение таких исследований велико, поскольку они могут позволить выявить наиболее удачные комбинации геномов ризобий, которые могут быть использованы в качестве основы для направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для практики.

Рациональное использование свойств аборигенных популяций ризобий, в перспективе, несомненно, является важным элементом биологизации земледелия и создания адаптивно-интенсивной стратегии растениеводства не только бобовых культур, но за счет использования ассоциативного симбиоза и других сельскохозяйственно значимых растений.

Создание искусственных азотфиксирующих ассоциаций культурных растений с эндофитными микроорганизмами, которые выделены из природных симбиозов, является относительно новым направлением в биоинженерии симбиотических систем. Клубеньковые бактерии могут также выступать и в качестве ассоциативных микросимбионтов для многих экономически ценных небобовых культур, таких как рис, кукуруза, пшеница, рапс, подсолнечник и т. д. Эти бактерии способны колонизировать корневую систему и повышать урожайность растений, выделяя ростостимулирующие вещества и защищая от фитопатогенов. Как показали исследования последних лет, ризобии принимают активное участие в усвоении растениями труднорастворимых соединений фосфора и даже, проникая в надземную часть растения, могут усиливать процесс фотосинтеза (Chi et al., 2005; Черемных и др., 2007; Perrine-Walker et al., 2007). Поэтому получение искусственных симбиотических ассоциаций этих бактерий с различными видами растений является одним из наиболее перспективных направлений на пути создания экологически ориентированного сельского хозяйства. Вместе с тем, следует отметить, что эти процессы неконтролируемы, и в естественных условиях ризосферные бактерии с полезными признаками, к сожалению, не выдерживают конкуренции и вытесняются более агрессивными бактериями, зачастую обладающими фитопатогенными свойствами. Задача исследователей состоит в том, чтобы придать растениям способность контролировать микрофлору своей ризосферы.

Цель работы заключалась в исследовании генетического разнообразия и филогении клубеньковых бактерий дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала и разработке подходов для использования биологического потенциала данных бактерий при культивировании небобовых хозяйственно-ценных растений.

1. Собрать коллекцию штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала, проанализировать их генетическое разнообразие и определить филогенетическое положение.

2. С целью выявления возможности влияния горизонтального переноса генов на видовое разнообразие микросимбионтов исследованных растений провести филогенетический анализ симбиотических и 16S рибосомных генов.

3. Создать плазмидные конструкции для мечения клубеньковых бактерий флуоресцентными белками и получить маркированные штаммы для их детекции in vivo и in vitro.

4. Провести анализ полиморфизма генов лектинов представителей рода Lalhyrus, вступающих в симбиоз с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae.

5. Оценить специфичность взаимодействия лектинов из семян гороха посевного и козлятника восточного с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae и Rhizobium galegae.

6. Исследовать возможность адгезии клеток ризобий Rhizobium leguminosarum bv. viciae на контрольных и трансгенных по гену лектина psl бородатых корнях растений рапса и табака.

7. На модельных растениях трансгенного табака и композитных растений томата и рапса изучить возможность специфичной колонизации их ризосферы целевым видом клубеньковых бактерий в условиях конкуренции с почвенной микрофлорой.

Научная новизна. Изолировано более 1200 штаммов ризобий из клубеньков 36-ти видов дикорастущих бобовых растений, относящихся к 12-ти родам. Исследовано их генетическое разнообразие и на основе сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК определено их филогенетическое положение.

Выявлено, что для штаммов ризобий, выделенных из клубеньков дикорастущих видов растений трибы Vicieae, которые по последовательности генов 16S рРНК за небольшим исключением относятся к виду Rhizobium leguminosarum, характерна высокая степень гетерогенности, обусловленная различиями в их плазмидном составе, вызванная, предположительно, высокой трансмиссивностью мобильной части их генома. С помощью кластерного анализа RAPD-фингерпринтов данных штаммов обнаружено, что внутри популяции клубеньковых бактерий существует разделение на субпопуляции, рекомбинационные процессы между которыми имеют определенные ограничения.

Несмотря на то, что почти все исследованные штаммы, вступающие в симбиоз с растениями трибы Vicieae, относились к Rhizobium leguminosarum, у некоторых видов растений рода Lathyrus в клубеньках были обнаружены

бактерии, не являющиеся типичными симбионтами для этих растений. Так, в клубеньках у L. vermis и L. sylvestris идентифицированы ризобии, близкие к R. tropici, у L. pahisíris — бактерии, близкие к Agrobacterium sp., а у L. gmelinii — к Phyllobacterium sp. Выявлено, что симбиотические гены данных артефактных бактерий имеют филогенетическое родство с аналогичными генами, ранее описанными у бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae, что, скорее всего, и является причиной изменения их специфичности.

Показано, что основными симбионтами дикорастущих видов бобовых растений подтрибы Astragalinae трибы Galegeae в условиях Южного Урала являются бактерии рода Mesorhizobinm, хотя некоторые виды растений данной подтрибы в зависимости от почвенно-климатических условий способны вступать в симбиоз и с представителями других родов ризобий, таких как Rhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer. Для растений трибы Genisteae характерно преобладание в клубеньках бактерий рода Bradyrhizobium, для растений трибы Hedysareae — Mesorhizobium. Все полученные из клубеньков растений Coronilla varia (триба Loteae) штаммы бактерий по последовательности генов 16S рРНК оказались близки к бактериям Rhizobium leguminosarum.

У штамма ризобии, изолированного из клубенька Н. razoumowianum, близкого по последовательности гена 16S рРНК к Bradyrhizobium, обнаружен ген ni/H, имеющий заметно большую гомологию с аналогичными генами, описанными у Mesorhizobium, что может служить аргументом в пользу горизонтального переноса генов.

Создана серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, предназначенных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий. Векторы на основе репликона широкого круга хозяев pBBRI предназначены для мечения штаммов с экспрессией маркерного гена с трансформируемой плазмиды, а векторы на основе плазмиды pRL765gfp созданы для маркирования штаммов путем введения генов флуоресцентных белков в состав хромосомы бактерий.

Показано, что для переноса конструкций в клетки клубеньковых бактерий наиболее предпочтителен метод трансформации, поскольку при наличии mob-участка в векторах, необходимых для конъюгативного переноса, возможна случайная мобилизация плазмиды и ее переход из клеток маркированных штаммов в другие почвенные бактерии.

У растений L. vernus, L. palustris и L. gmelinii обнаружено несколько изоформ лектинов, что может быть причиной выявленной в работе пластичности при выборе микросимбионтов данными видами растений.

Показана специфичность агглютинации лектинами из семян гороха посевного (Pisum sativum) (PSL) ризобий К leguminosarum bv. viciae, и лектинами из семян козлятника восточного (Galega orientalis) (GOL) — R. galegae.

Продемонстрировано, что используя гены лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, можно создавать искусственные ассоциации клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями. На трансгенных по гену лектина PSL гороха растениях табака показана избирательность колонизации их ризосферы бактериями R. leguminosarum bv. viciae в условиях конкуренции с естественной микрофлорой почвы.

Практическая значимость работы. Собрана и генетически охарактеризована коллекция штаммов клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими бобовыми растениями Южного Урала. Сведения о генетическом разнообразии и филогении клубеньковых бактерий, полученные в ходе исследований, могут быть использованы как для селекции высокоэффективных и приспособленных к почвенно-климатическим условиям Южного Урала штаммов клубеньковых бактерий, так и для создания штаммов ризобий с полезными для сельского хозяйства признаками. В связи с тесным взаимодействием бобовых растений со своими микросимбионтами, зачастую определяющих их экологическую нишу и нередко ареал распространения, новые знания о молекулярно-генетических особенностях и биоразнообразии клубеньковых бактерий таких краснокнижных видов бобовых как L. litvinovii, A. cornutus, A. helmii, Н. grandiflorum, Н. razoumowianum, О. hippolyti сделают возможным успешное интродуцирование этих растений из неблагоприятных мест в другие районы, и тем самым обеспечат их сохранение.

Серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, созданных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий, может быть использована для научных экспериментов в области изучения бобово-ризобиальных симбиозов.

Разработанный экспериментальный подход к конструированию «искусственной ризосферы» несимбиотрофных растений, избирательно колонизируемой клубеньковыми бактериями (выполняющими полезные для

растений трофические, ростостимулирующие и/или защитные функции), путем введения в их геном в качестве трансгена гена лектина бобового растения, с которым данные ризобии вступают в симбиоз, может быть использован для создания стабильных и эффективных ассоциаций хозяйственно-полезных растений с ростостимулирующими азотфиксирующими микроорганизмами, которые могут найти самое широкое коммерческое применение в сельскохозяйственном производстве. Основные положения, выносимые на защиту

1. Клубеньковые бактерии дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала представлены всеми основными родами ризобий: КЫгоЫит, МеБогЫгоЫит, Ет1/ег (БтогЫюЫит), ВгадугЫгоЫит.

2. Основными симбионтами дикорастущих видов бобовых растений подтрибы АзЬ^аШше трибы Са^еае и трибы Неёувагеае в почвенно-климатических условиях Южного Урала являются бактерии рода МезогЫгоЫит.

3. Для растений трибы Оеш51еае характерно преобладание в клубеньках бактерий рода ВгафгЫгоЫит.

4. Для клубеньковых бактерий дикорастущих видов растений трибы Ую1еае, относящихся к виду ЯЫгоЫит \е%иттозагит, характерна высокая степень гетерогенности, обусловленная различиями в их плазмидном составе.

5. Используя гены лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, можно создавать искусственные ассоциации клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье (№ 10-04-97018_а) и грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ России (НШ-1003.2006.4 и НШ-649.2008.4), ПС N02.740.11.0290 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2020гг.» Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006); Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006); Ш Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2006); Всероссийской

конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); V Всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2020); 14-й международной Путинской школе-конференции молодых учёных «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2020); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)» (Москва, 2020); VI Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2020); Международной конференции «Микробиология в решении современных проблем сельскохозяйственной микробиологии» (Санкт-Петербург, 2020). Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 34 печатных работах, в том числе, 16 статей опубликованы в журналах из Перечня ВАК, из них 13 из международной базы цитирования, в 1-й монографии, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах, содержит 36 рисунков и 6 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 667 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектами исследования в данной работе служили клубеньковые бактерии, выделенные из клубеньков дикорастущих бобовых растений Южного Урала: горошка заборного (Vicia sepium L.), Г. тонколистного (V. termifolia Roth), Г. лесного (V. sylvatica L.), Г. гороховидного (V. pisiformis L.), Г. мышиного (V. cracca L.), Г. волосистого (V. hirsuta (L.) Gray), чины весенней (Lathyrus vernus L. BeraJhJ, Ч. Гмелина (L. gmelinii Fritsch), Ч. клубненосной (L. tuberosus L.), Ч. луговой (Z. pratensis L.), Ч. Литвинова (L. litvinovii Iljin), Ч. лесной (L. sylvestris L.), Ч. гороховидной (L pisiformis L.), Ч. болотной (L. palustris L.), Ч. бледноватой (L. pallescens (Bieb.) C. Koch), караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.), К. кустарниковой (С. frutex (L.) C.Koch), лядвенца украинского (Lotus ucrainicus Klokov), вязеля разноцветного (Coronilla varia L.), дрока красильного (Genista tinctoria L.), ракитника русского

В исследованиях по специфичности взаимодействия лектинов с клубеньковыми бактериями использовали штаммы, полученные из Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (С.-Петербург): CIAM 0702 Rhizobium galegae и CIAM 1078 R. leguminosarum bv. viciae, вступающие в эффективный симбиоз с козлятником восточным (Galega orientalis) и горохом посевным (Pisam sativum), соответственно.

В работе использованы следующие методы. Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, анализ рекомбинантных клонов, клонирование амплифицированной ДНК в плазмидных векторах, расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами, подготовку компетентных клеток и их трансформацию плазмидной ДНК, электрофорез фрагментов ДНК и их элюцию из легкоплавкой агарозы проводили по прописям, изложенным в лабораторном руководстве Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). ДНК мегаплазмид ризобий выделяли методом Экхардта с некоторыми модификациями (Eckhardt, 1978). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. RAPD-анализ проводили в амплификаторе «TI Thermocycler» фирмы «Biometra» (Германия) в течение 25 — 30 циклов при температурах отжига от 32°С до 48°С для разных праймеров. Кластерный анализ RAPD-профилей проводили с помощью компьютерной программы GelComparll (Applied Maths) с использованием метода невзвешенного попарного среднего — Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages (UPGMA). Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для

секвенирования «Big Dye Terminator v.3.0». Анализ нуклеотидных последовательностей генов и выведенных на их основе аминокислотных последовательностей белков проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США). Трансгенные растения табака получали методом агробактериальной трансформации листовых пластинок (Horsh, Fry, 1985). Визуализацию взаимодействий клубеньковых бактерий с корневыми волосками трансгенных растений осуществляли при помощи универсального флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager.Ml (Carl Zeiss, Германия) и Biozero (Keyence, Япония). Процентное содержание клеток клубеньковых бактерий, содержащих маркирующе белки, определяли на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 («Beckman Coulter»).

‘ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий бобовых трибы Vlcieae. Триба Виковых (Vicieae (Adans.) Bronn) (Fabaceae) объединяет рода Lathyrus L. (чина), Pisum L. (горох), Vicia L. (горошек) и Lens Mill, (чечевица). В умеренных широтах к данной трибе относятся большинство хозяйственно-значимых видов бобовых растений. К дикорастущим видам на Южном Урале в основном относятся представители двух родов: Vicia L. -горошек, или вика и Lathyrus L. — чина. Считается, что представители данной трибы образуют группу перекрестной инокуляции и вступают в симбиоз с различными штаммами вида Rhizobium leguminosarum bv. viciae.

Нами были проанализированы клубеньковые бактерии из клубеньков 6 видов растений рода Vicia и 9 видов растений рода Lathyrus (табл. 1).

Анализ гетерогенности собранных штаммов методом RAPD выявил, что клубеньковые бактерии всех взятых в анализ растений отличаются высокой степенью полиморфности ДНК. В наших исследованиях наиболее гетерогенными оказались микросимбионты L. tuberosus, где индекс разнообразия Шеннона составил 0,84. Менее разнородными оказались микросимбионты L. litvinovii и L. palustris, где данные индексы были равными 0,39 и 0,36 соответственно (табл. 1).

Предварительные исследования филогении исследуемых клубеньковых бактерий методом ПДРФ-анализа гена 16S рРНК выявили, несмотря на высокую гетерогенность штаммов бактерий, достаточно высокую их

филогенетическую однородность (табл. 1).

Состав и генетическая характеристика штаммов клубеньковых бактерий, изолированных из клубеньков дикорастущих бобовых трибы Ук1еае

Вид растения-хозяина Количество выделенных штаммов Количество гомогенных по RAPD групп штаммов Индекс разнообразия Шеннона (Ms) Кол-во групп штаммов, гомогенных по 165-ПДРФ Предполагаемый вид бактерий и их %-ное содержание к обшему кол-ву выявленных у данного вида растения штаммов

V. tenuifolia 24 16 0,62 1 Я 1е^тто5агит

V. sepium 50 21 0,73 1 Я Ы^иттонатт

V. sylvatica 60 42 0,78 2 Я. 1ефтппо5атт

V. pisiformis 30 23 0,53 2 Я к^ттозагит

V. cracca 57 27 0,65 1 Я 1е^тто$агит

V. hirsuta 25 14 0,55 1 Я 1е%итто5агит

L. litvinovii 63 20 0,36 1 Я к^ттохатт

L. palustris 42 13 0,39 3 Я. ¡е&ттояагит 79%

1 Ар оЬааепит зр. 21%

L. pallescens 77 40 0,51 3 Я 1ерттохагит

L. pisiformis 51 42 0,80 4 Я. ¡е^ттоьагит

L. vernus 159 120 0,72 1 Я. Ггорю; 70%

4 Я. 1е^тто$агит 30%

L. sylvestris 78 59 0,70 1 Я и-орШ 67%

1 Я. ¡е^ттозагыт 33%

L. tuberosus 49 40 0,84 2 Я !eguminosarum

L. pratensis 19 11 0,63 3 Я ¡е^пипозагит

L. gmelinii 5 — — 2 РИу11оЬас1егшт ¡р.

Определение филогенетического положения исследуемых штаммов клубеньковых бактерий по сравнительному анализу их секвенированных фрагментов генов 16S рРНК размером примерно 1400 п.н. с уже известными аналогичными последовательностями из базы данных GenBank и RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) показало, что последовательности гена 16S рРНК у большинства исследованных микроорганизмов имеют высокое сходство с последовательностями аналогичных генов Rhizobium leguminosarum (>99,5%).

Наряду с этим у некоторых растений обнаружены микросимбионты филогенетически близкие к другим видам бактерий. У L. vernus и L. sylvestris

были обнаружены ризобии, близкие (99,7%) к R tropici, у чины болотной в клубеньках обнаружены бактерии, близкие (98,2%) к Agrobacterium albertimagni, ay L. gmelinii — к Phyllobacterium myrsinacearum (99,9%).

Таким образом, показано, что все взятые в анализ представители трибы Vicieae (кроме L. gmelinii, у которой были обнаружили в клубеньках только бактерии, близкие к Phyllobacterium myrsinacearum), вступают в симбиоз со штаммами клубеньковых бактерий, хотя и отличающихся высоким полиморфизмом ДНК, но филогенетически родственных R. leguminosarum (>99,5% сходства по последовательности гена 16S рРНК), что подтверждает вхождение данных растений в одну группу перекрестной инокуляции.

Тем не менее, обнаруженные нами в клубеньках некоторых видов растений рода Lathyrus отличных от R. leguminosarum видов ризобий говорит о том, что в некоторых отдельных случаях границы данной группы перекрестной инокуляции могут быть расширены. Такие исключительные случаи возникают, скорее всего, в ходе адаптации растений к определенным условиям произрастания.

Несомненно, обращает на себя внимание высокий полиморфизм ДНК штаммов, вступающих в симбиоз с растениями трибы Vicieae. Подобная высокая гетерогенность исследуемых штаммов при филогенетической однородности позволяет предположить, что штаммы имеют различия в подвижной часта их генома, в том числе и мегаплазмид.

Действительно, при исследовании плазмидных профилей полученных клубеньковых бактерий обнаружилось, что все полиморфные по ДНК штаммы микросимбионтов внутри филогенетически однородных групп имеют различный состав плазмид. Разброс плазмид по количеству среди штаммов варьировал от 2 до 13 и по размеру приблизительно от 150 до 1000 тпн (рис. 1).

Значительные различия плазмидного состава штаммов филогенетически однородных бактерий говорят о довольно высокой трансмиссивности их плазмид, и, вследствие чего, высокой частоте генетической рекомбинации между ризосферными бактериями, приводящей к появлению большого количества высокополиморфных по ДНК штаммов.

<> 10 ¡1 12 13 1-4 15 Н> 17 23 24

Рис. 1. Ппазмидные профили штаммов ризобий, вступающих в симбиоз с чиной весенней,

относящихся к одной филогенетически однородной группе. Размер указан в тысячах пар нуклеотидов. Цифрами обозначены номера штаммов.

С помощью кластерного анализа ИАРО профилей клубеньковых бактерий растений чины весенней, относящихся к Я. 1е^ттозагит, показано, что в ризосфере одной популяции данного растения клубеньковые бактерии разделены на отдельные группы, рекомбинационные процессы между которыми, скорее всего, имеют определенные ограничения, что приводит к увеличению их генетических различий, отраженных на дендрограмме в виде образования отдельных кластеров А и Б так же, как и их географическое разделение (кластер В) (рис. 2).

Рис. 2. Дендрограмма, построенная на основе кластерного анализа КАРБ профилей клубеньковых бактерий Я. к^ттоБагит, полученных из клубеньков растений чины весенней. А и Б — ЛАРО профили бактерий, изолированных из клубеньков растений одной популяции, произрастающей в Татышлинском районе РБ; В — ИАРБ профили бактерий, изолированных из клубеньков растений, произрастающих в Белорецком районе РБ; Г — ИАРО профили бактерий, изолированных из клубеньков чины лесной. Одним цветом показаны бактерии, полученные из клубеньков одного растения.

Исследование влияния горизонтального переноса генов на видовой состав клубеньковых бактерий растений рода Lathyrus. Многочисленные работы показывают, что горизонтальный перенос sym генов является неотъемлемой частью в эволюции симбиотических взаимоотношений ризобий и бобовых растений (Freiberg et al., 1997; Bailly et al., 2007; Estrella et al., 2009; Marchetti et al., 2009). С целью выявления возможного влияния процесса горизонтального переноса sym генов на изменение специфичности микросимбионтов растений рода Lathyrus, относящихся по последовательностям генов 16S рРНК к R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., была исследована филогения их симбиотических генов nifli, nifD и nodA.

Сравнительный анализ секвенированых фрагментов генов nifH и nodA показал высокую гомологию между последовательностями всех исследуемых штаммов. Поиск сходных последовательностей в базе данных выявил, что секвенированные фрагменты генов nifH всех исследуемых штаммов клубеньковых бактерий имеют высокую гомологию с аналогичными последовательностями бактерий вида R. leguminosarum bv. viciae, что показывает их филогенетическую близость (рис. 3).

!& trapfcl ил. 1.3 (L. venitu) R. leginBiamriuit шт. II (L- venilla) Я. IcRurninoiarnin on. 12 (L- vernss) Agrobacterium sp. шт. 7 (L. palolirli) R. Icguminosamm ют. CCBAU 75064 [Е1Л77?!») R. legumfMiuniiii uir. 1079 (P. uliviuo) I AgnibKtérllua «p. nrr.14 (L. palBSfrfr) PkyUotncteriaiH sp. ml (L gmettnU) R. tfnptd uti. SJ (L. vernal)

R. tropkl an. 4.10 (U iTmas) R. mpid un. IS (U venin)

‘— R- rcguminasanira bv. vieille un. 3641 ( NC_0083B1) — R. kguminuMium bv. ftiblii WSM 13M(NC_0)2S48 )

. Khizobium tropici urr. RP261 ( DQ4I3021)

«» Sinoriüzobiuni meliloti un. 1021 (ЛЕ006469)

flnylytlnatbuim japor.iLiim itn. USDA 110 (BAOOWMO 2)

30 25 20 15 10 5 0 NuclcwideSubstiluliora (я 100)

Рис.3. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа последовательностей генов nifH. Исследуемые штаммы указаны жирным шрифтом.

У штаммов Л tropici и R. leguminosarum, нодулирующих растения L vernus, были также амплифицированы и секвенированы фрагменты генов nifD. Сравнительный анализ секвенированных фрагментов с аналогичными последовательностями других клубеньковых бактерий, депонированных в

GenBank, также показал их высокую гомологию с генами nifD R. leguminosarum bv. viciae.

Полученные результаты, показывающие филогенетическую близость симбиотических генов исследуемых клубеньковых бактерий с аналогичными генами R. leguminosarum bv. viciae, свидетельствует в пользу имевшего место горизонтального переноса симбиотических генов R. leguminosarum bv. viciae в штаммы R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., что и явилось причиной возможности образования клубеньков данными бактериями на корнях растений рода Lathyrus.

В работах многих авторов показано, что немаловажную роль в узнавании симбиотических партнеров в азотфиксирующем симбиозе также играют лектины бобовых растений, которые за счет своей углевод-связывающей активности специфично взаимодействуют с сахарными остатками на клеточной стенке ризобий, обеспечивая тесное взаимодействие симбиотических партнеров, что облегчает их взаимное узнавание (Hamblin and Kent 1973; De Hoff, 2009) Специфичность лектинов напрямую связано со структурой их углевод-связывающего пептида (УСП).

Как правило, гены лектинов бобовых растений, вступающих в симбиоз с одними и теми же штаммами ризобий, характеризуются высокой гомологией последовательностей УСП. Кроме того, имеющиеся замены в УСП растений, входящих в одну группу перекрестной инокуляции, в большинстве случаев представляют собой замены на подобные аминокислоты. У растений L. vernus, L. palustris и L. gmelinii нами были обнаружены, клонированы и секвенированы по три различающихся гена лектина.

При анализе выведенных аминокислотных последовательностей УСП секвенированных лектинов чин были обнаружены заметные их различия по консервативным аминокислотам. Так, во всех трех фрагментах лектинов LGmL 1, 2, 6 в позиции 126 Ala заменен на Pro, кроме того, у LGmL 6 в 127-й позиции Ala заменен на отрицательно заряженный Glu. У LPaL 3 в 126-м положении неполярная аминокислота Ala заменена на полярный Thr. В той же позиции замены во всех трех фрагментах лектинов L. vernus: у LVeL 9 на Leu, у LVeL 10 на Ile, а у LVeL 13 на Thr. Также у LVeL 9 и LVeL 10 в позиции 124 вместо Туг стоит положительно заряженный Arg, а в позиции 135 положительно заряженный Arg заменен на полярные незаряженные аминокислоты Thr и Ser, соответственно. Кроме того, у этих двух лектинов в вариабельном участке УСП

присутствует делеция нескольких аминокислот. В результате изменяется длина петли, в которой находится УСП. Как можно видеть из рис. 4, большинство вышеуказанных замен в УСП лектинов чин приходятся на консервативные аминокислоты, определяющие углеводспецифичность лектинов у растений трибы Умиеае. Также у ЬРаЬ 3 в позиции 136 положительно заряженный гистидин, который является инвариантной аминокислотой УСП лектина, связывающей ионы металлов и стабилизирующей пространственную структуру белка, заменен на полярный незаряженный глутамин. Эта замена может оказать существенное влияние на функциональную активность данного белка.

Таким образом, по всей видимости, у каждого исследованного нами вида растений рода ЬейИугиз секвенированы несколько генов лектинов, которые могут кодировать изолектины.

удукгоггамдмпрзмкжиБЮ удуяпуг рзмстя1с1р удумпипиянаезнпрюист удмгвггйитадиыбкв»! сю

УАУКЕРТГШТДЯР?ЗРСНН01Е1Р УАУкпстгамлврргмкиЕИ! с I о УАУВПИТГШАМ^НЕРКНХОт №.’ЕГ&тгевмьрР5—Узт г»

УАУЕ ПГГЛТВТЛМЗРЯНЕННИ! Г.10 УАУВГРТКУ1МАЯР?5НК£КЯ1С 10

тач’вгрггтадигевмбкйа! Й I о удУвЯтгпмл мз?5Ывиач б гв

Раит хоА’ушя Юа11 ИтЬутя цтейпй) 10т1_ 2 (Шкугих ^теЛяЮ 1Ст1.6 П.шкутз ртеИлп) ЬРаЬ 3 (ЫкутраШН*) ¿РаС 7 (1аЛупа’ра1ш/п5,) ЬРаЬ 30 (ШкупярЫиПп?) £ Уе1 9 (ЬиНупи чети.г/

/, Не/. ¡0 (1 ткут* \ej-nus)

1Уе113 (ЬиЬупи яелии) 1.епз сыЬпаги Кюо /аЬа I

Рис. 4. Сравнительный анализ выведенных аминокислотных последовательностей УСП лектинов ЬМкугш эр. и некоторых других видов бобовых растений трибы Угс1еае. Последовательности УСП подчеркнуты. Жирным шрифтом выделены аминокислоты, участвующие в связывании ионов металлов. Цифрами указаны положения аминокислот относительно лектина гороха. Курсивом выделены аминокислоты, определяющие в УСП растений трибы \ЧЫеае специфичность связывания лектина с моносахаридом. Дефисами указаны делеции.

В составе первичной структуры исследованных нами фрагментов лектинов, как уже описывалось выше, имеют место замены, способные существенным образом повлиять на свойства соответствующего белка, что может сказаться на изменении специфичности при взаимодействии бобового растения с микросимбионтами. Наличие же нескольких изоформ данного белка у одного вида растения может объяснить пластичность в некоторых случаях

при выборе растением «своего» микросимбионта, что может являться одним из механизмов приспособления к различным почвенно-климатическим условиям.

Исследование эффективности штаммов /?. 1горШ, Agrobacteгium яр. и РЬуПоЬас/егшт $/>., обнаруженных в клубеньках растений рода ЬаЛугю. Эффективность клубеньковых бактерий оценивали по массе надземной части опытного растения чины посевной. После 30 дней выращивания было выявлено достоверное отличие в массе надземных частей растений, инокулированных штаммами Я &орт, Agrobacterium эр. по сравнению с контролем (без инокуляции), тогда как растения, инокулированные штаммом РИу11оЬас1егшт Бр. от контроля по массе не отличались (рис. 5).

ги«дит1поягит я.1гор1с1 Адп>Ьдс(ег1ит ер. РЪу11оЬас(ег)ит контр. 1078 «р.

Рис. 5. Влияние инокуляции штаммами Я 1горш, Agrobacíerium ер., и РИуПоЬаМегтт Бр., выделенных из клубеньков некоторых видов растений рода ЬшИугш на изменение массы 30-ти дневных растений ЬмИугш яаИуиз. В качестве положительного контроля взяты растения, инокулированные Я leguminosarum 1078, в качестве отрицательного контроля — без инокуляции.

При визуальном обследовании образовавшихся клубеньков было обнаружено, что немногочисленные клубеньки (3-5 шт. на растение), образованные РИу11оЬас1егшт 5р., имели зеленый окрас, что говорит об их нефункциональности. Клубеньки же, образованные Я 1горт и Agrobacterium Бр., имели розовый цвет и были более многочисленными (15-28 шт. на растение) (рис. 6).

R. tropici Agrobacterium sp. Phyllobacterium sp.

Рис. 6. Клубеньки на корнях чины посевной, образованные R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., выявленными в клубеньках разных видов чин.

Можно предположить, что при получении симбиотических генов от R. leguminosarum у штаммов близкородственных видов R. tropici и Agrobacterium sp. произошло не только изменение специфичности, но также появилась способность к азотфиксирующему симбиозу. В то же время у штаммов неродственного вида Phyllobacterium sp. возникла возможность к образованию лишь неэффективных клубеньков.

Тем не менее, проанализированные штаммы R. tropici и Agrobacterium sp. заметно уступали производственному штамму R. leguminosarum 1078 как по эффективности, так и по количеству образуемых клубеньков (35-58 шт. на растение).

Эффективность клубеньковых бактерий является полигенным фактором, и при этом наличие симбиотических генов, локализованных в одной лишь sym-плазмиде, может быть недостаточно для успешного образования азотфиксирующего симбиоза, поскольку некоторая часть необходимых для этого генов может находиться или на хромосоме или на других плазмидах (Young, 2006; González, 2006). Поэтому шанс возникновения удачного сочетания необходимых для этого генов высок при рекомбинации между родственными микроорганизмами, тогда как переход syw-плазмиды к неродственным бактериям не обеспечивает полноценной реализации программы образования азотфиксирующего клубенька, что мы и наблюдали в случае со штаммом Phyllobacterium sp., который способен был формировать лишь неэффективные клубеньки.

Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий трибы Galegeae. Данная триба на Южном Урале представлена 4 родами дикорастущих видов бобовых растений: Caragana Fabr. (Карагана), Astragalus L. (Астрагал), Oxytropis DC. (Остролодочник), объединенными в подтрибу Astragalinae и Glycyrrhiza L. (Солодка), а также интродуцированным видом Galega orientalis.

Были проанализированы клубеньковые бактерии 2-х видов караган, 6-ти видов астрагалов, 5-ти видов остролодочника и козлятника восточного

При анализе микроорганизмов из клубеньков данных растений была выявлена разная степень их гетерогенности. Ризобии растений Astragalus и Oxytropis внутри симбионтов одного вида оказались однородны. Исключение составили бактерии, изолированные из клубеньков A. cicer, у клубеньковых бактерий которого в одной из точек сбора была обнаружена некоторая гетерогенность. Тем не менее, RAPD фингерпринты их ДНК в своем составе содержали большое количество (до 60% от общего числа для отдельных праймеров) совпадающих полос (рис. 7). С помощью 16S ПДРФ-анализа было выявлено, что штаммы, полученные из разных точек сбора, отличаются своей филогенией.

Рис. 7. Электрофореграмма КАРБ анализа амплифицированной ДНК штаммов бактерий (1-20) из клубеньков астрагала нутового с использованием произвольного

олигонуклеотидного праймера 5′-САОССССТТС-3′

У микросимбионтов растений рода Caragana также обнаружены отличия как в полиморфности ДНК штаммов, так и в скорости их роста на питательных средах. Из 54 изолированных штаммов у Caragam /гШех к медленнорастущим можно было отнести 34 штамма, у Caragana агЬогеасет из 85 изолированных штаммов — 80. 16Б ПДРФ анализ выявил, что микросимбионты Caraganaр-и1ех образуют 5 монофилетических групп, а микросимбионты Caragana агЬогезсет — 10. Примечательно то, что у Са^апа агЬогезсет быстрорастущие штаммы объединены в одну монофилстическую группу, а медленнорастущие по 165

ПДРФ профилям проявляли отличия между собой только при применении рестриктазы Mspl, а при использовании рестриктазы AIuI отличий обнаружено не было, что говорит о близком родстве представителей группы медленнорастущих штаммов данного растения. Филогенетический анализ на основании сравнения последовательностей гена 16S рРНК показал, что все исследованные штаммы ризобий растений рода Astragalus и Oxytropis, кроме штаммов A. wolgensis и части штаммов A. cicer, близки к бактериям рода Mesorhizobium. Тем не менее, на филогенетическом древе, построенном на основании множественного выравнивания последовательностей генов 16S рРНК ризобий (рис. 8) симбионты A. helmii и A. macropus ближе к виду Mesorhizobium plurifarium, симбионты A. cornutus и О. sordida — к М. huakuii; симбионта C.Jrutex и О. spicata -к М. mediterraneum, симбионты A. cicer и О. hippolyti — к Mesorhizobium tianshanense; симбионты Astragalus danicus и О. pilosa — к Mesorhizobium loti, О. floribunda — к Mesorhizobium alhagi. Бактерии из клубеньков A. wolgensis имеют высокое родство с Ensifer (Sinorhizobium) meliloti, а у A. cicer все клубеньковые бактерии, собранные в точке сбора, в которой полученные штаммы имели некую гетерогенность, имеют родство с Agrobacterium sp. Все медленнорастущие штаммы Caragana arborescens оказались близки к бактериям рода Mesorhizobium: Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium loti и Mesorhizobium caragana (рис. 9).

Интересным является тот факт, что у данного интродуцированного из Дальнего Востока вида растения, произрастающего за тысячи километров от естественного ареала произрастания, состав клубеньковых бактерий оказался идентичен составу клубеньковых бактерий, описанных Yan (2007) у растений, произрастающих в Китае, что говорит о высокой степени специфичности симбиоза данного растения.

Клубеньковые же бактерии Caragana Jrutex оказались весьма разнообразны. Из 5-ти монофилетических групп основная группа, включающая более половины анализированных штаммов, близка к бактериям Mesorhizobium sp., две группы — к бактериям Rhizobium sp., и по одной группе к Phyllobacterium sp., и Bradyrhizobium sp.

К подтрибе Galeginae трибы Galegeae относится один род — Galega. На Южном Урале чаще всего встречается вид Galega orientalis, интродуцированный из Кавказа как перспективная кормовая культура.

¿BKBAHS (Astragalus helmil) (JNlttOlll) Mesortlizobium phiriferium (DQ100068) BKBAMa (Aatragulus macropus) (JN180113) г ВКВАСоЗ (Astragalus cornutus) (JNIS0112) x BKBOSo2 (Oxytropu sordid») (JN180122) L- Mcsoibizobium himkiiji (D13431) r BKBCF3g (Carag.ua fnitei) (HQ5405821 -r Mesorilizobium meditenaneum (AY 195B43) L BKBOSpU (Oiytropls splcata) (JN1S0123) ■ BKBACtt (Astragalus clccr) (JN180114) —f Mcsortiizobmm tianshanense (AF041447)

1 ВКВОЫ11 (Oiylroph hlppolyrt) (JN180121) i- BKBLUia (Lotus ucralnlcus) (JN180119) J— Mesoriii2obium riceri (AY90473I) П J- 2-2 (Astragalus daolcns) (JNIWIOI) 1 ВКВОИ7 (Oivtropls рПоза) (JN180120) L»» МюиЫгоЫит loti (D145I4) . 2-1 (Astragalus danicus) (JNI80100)

r 12-1 (Hedysarom raxoumovjaniun) (JN180109) r 12-2 (Hedysaram nmmroovianum) (JN180110) r|- Mesortuzobium albagi (EU169578) H 13-1 (Hedysanuri grandiflorum) (JN180168) -I1— 13-2 (Hedynnun ртин)Шопто) (JN180102) 1— 01 (Olytropfs Oorlbuoda) (JN180106)

C2B (Chamaecythus rutbenkus) (JN180103) ONQBAR-25(Ooobrychls amiartaXDQ3726iJ) Phyllobacterium irifolu (AY786U80)

Ьшт т«И1еггапешт| (Ау195844) Ме$тЪш)Ыит р1ипГапит (Оц100068) МеаогЫгоЫит иашЬапике (АГО41447) РЬуЦоЬасКпйт $р. СА8 (Ц544Ш) РЪуПоЬасйпшп тугетасеагит НМ35 (А>011330) РКуНоб^епит 1енштпито (Ау785323) КтогЫгоЫит Аеш (ЯНМ1бЗкГН?) ЗиогЫгоЫиттеШоП (КНМ1651ШМ) Зшо^пгоЫит leraogaв (Кз7834) ШигоЬшт (Ау117629) ШигоЬшт кздтшозагйгп (ШШ1б8ЩЭО) ШигоЬшга gall^eшn (Ау509211)

КЬиоЫит даГе£ае.(1(НМ163КОВ) Ар-оЬаМепит (итейЫеш (Ау504963) АгогМгоЫит саиНпснЫлч (АС16КК) ВпиЯут^коЬшт е1Ьшш (АП39845) Вгас1уг1112оЬшт ]аротсшп (Ау904732)

Рис. 9. Древо сходства нуклеотидных последовательностей генов 16Б рР1Ж бактерий из клубеньков Са/^апа агЬогезсет.

При исследовании более 100 штаммов клубеньковых бактерий у растений в 15-летних посевах, выращиваемых без искусственной инокуляции на опытных полях Госсортоучастка с. Бузовьязы Кармаскалинского района Республики Башкортостан, было обнаружено, что полученные штаммы весьма однородны и по последовательности генов 16Б рРНК все принадлежат к виду К galegae. Таким образом, в условиях Южного Урала нам не удалось обнаружить местные бактерии, способные изначально или приспособившиеся позже заражать

козлятник восточный. Методом ПЦР было показано, что все полученные штаммы из клубеньков растений трибы Galegeae имеют в своем составе симбиотические гены, кроме бактерий из клубеньков Caragana frutex по последовательности 16S рРНК близких к роду Phyllobacterium, у которых амплифицировать симбиотические гены стандартными праймерами не удалось (табл. 2).

Состав и генетическая характеристика штаммов клубеньковых бактерий,

изолированных из клубеньков бобовых растений трибы Galegeae

Растение-хозяин Кол-во выделенных штаммов Количество групп штаммов, гомогенных по 16S- ПДРФ Предполагаемый вид бактерий и их процентное соотношение у одного и того же Наличие симбиотических генов

Mesorhizobium sp. 58% +

Caragana Jrutex 54 5 Rhizobium sp. 18% +

Phyllobacterium sp. 18% Bradyrhizobium sp. 6% +

Caragana 85 10 Mesorhizobium sp. 94% +

arborescens Phyllobacterium sp. 6% +

Astragalus danicus 10 1 Mesorhizobium sp. -r-

A. macropus 10 1 Mesorhizobium sp. +

A. comutus 5 1 Mesorhizobium sp. +

A.wolgensis 10 1 Ensifer sp. +

A. helmii 10 1 Mesorhizobium sp. +

A. cicer 10+80 2 Mesorhizobium sp. 12% Agrobacterium sp. 88% + +

Oxytropis sórdida 5 1 Mesorhizobium sp. +

O. hippolyti 5 1 Mesorhizobium sp. +

0. pilosa 5 1 Mesorhizobium sp. +

0. floribunda 5 1 Mesorhizobium sp. +

O. spicata 4 1 Mesorhizobium sp. +

Galega orientalis >100 1 Rhizobium galegae +

Сравнение филогении генов 16S рРНК и nifH взятых в анализ клубеньковых бактерий в целом не выявил их различий. Исключение составили штаммы Phyllobacterium sp. из клубеньков Caragana arborescens, у которых ген nifH имеет высокую гомологию с аналогичными генами бактерий рода Mesorhizobium.

Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий трибы Loteae, Genisteae и Hedysareae. Трибы Loteae, Genisteae и Hedysareae на Южном Урале представлены относительно небольшими количествоми родов и видов. Так, например, триба Loteae представлена двумя родами дикорастущих бобовых: Lotus (2 вида) и Coronilla, (1 вид); триба Genisteae — двумя родами: Genista (1 вид) и Chamaecytisus (2 вида); триба Hedysareae — двумя родами: Hedysarum (5 видов) и Onobrychis (1 вид). Были проанализированы клубеньковые бактерии следующих видов растений: лядвенеца украинского (Lotus ucrainicus), вязеля разноцветного (Coronilla varia), дрока красильного (Genista tinctoria), ракитника русского (Chamaecytisus ruthenicus), копеечника крупноцветкового (Hedysarum grandiflorum), копеечника Разумовского (Hedysarum razoumowianum) и эспарцета песчаного (Onobrychis arenaria). Анализ гетерогенности методом PAPD выявил разную степень полиморфности ДНК у штаммов в зависимости от их растения-хозяина. У растений Lotus ucrainicus, Hedysarum grandiflorum и Onobrychis arenaria исследованные штаммы клубеньковых бактерий оказались однородны, а микросимбионты остальных растений имели разную степень гетерогенности. Первичный филогенетический анализ методом 16S ПДРФ выявил разделение штаммов Genista tinctoria на 5 монофилетических групп, а микросимбионтов Coronilla varia, Chamaecytisus ruthenicus и Hedysarum razoumowianum на 2 группы. Филогенетический анализ на основе сравнения генов 16S рРНК показал (рис. 8), что все исследуемые штаммы ризобий из клубеньков Lotus ucrainicus близки к бактериям Mesorhizobium ciceri, а обе монофилетические группы микросимбионтов родственного вида Coronilla varia к Rhizobium leguminosarum. Самую высокую разнородность показали клубеньковые бактерии из клубеньков Genista tinctoria, которые по последовательности генов 16S рРНК оказались близки Bradyrhizobium elkanii., Rhizobium sp. и Phyllobacterium sp. Микросимбионты Chamaecytisus ruthenicus оказались близки к Bradyrhizobium elkanii и Phyllobacterium sp., микросимбионты Onobrychis arenaria — Phyllobacterium trifolii (табл. 3).

Клубеньковые бактерии растений рода Hedysarum (Hedysarum grandiflorum и H. razoumowianum) совместно с микросимбионтами Oxytropis floribunda на филогенетическом древе образуют отдельную ветвь. По последовательности генов 16S рРНК данные бактерии похожи на недавно описанный вид Mesorhizobium alhagi, штаммы которого первоначально выявлены в клубеньках Alhagi sparsifolia (Chen et al., 2020). Минорный же штамм из клубенька

Я. гагоитотапит, имеет родство с Вгас1угМгоЫит е1капи.

Состав и генетическая характеристика штаммов клубеньковых бактерий из клубеньков дикорастущих видов бобовых трибы Ьо1еае, Оеш51еае и Нес1узагеае

Растение-хозяин Кол-во вьщеленны x штаммов Количество групп штаммов, гомогенных по 16S- ПДРФ Предполагаемый вид бактерий и их процентное соотношение у одного и того же растения Наличие симбиотических генов

Lotus ucrainicus 5 1 Mesorhizobium loti +

Coronilla varia 24 2 Rhizobium leguminosarum +

Genista tinctoria 18 5 Bradyrhizobium sp. 61% Rhizobium sp. 22,3% Phyllobacterium sp. 16,7% + +

Chamaecytisiis ruthenicus 5 2 Bradyrhizobium sp. 60% Phyllobacterium sp. 40% + +

Hedysarum grandiflorum 5 1 Mesorhizobium sp. +

H. razoumowianum 4 2 Mesorhizobium sp. 75% Bradyrhizobium sp. 25% + +

Onobrychis arenaria > 100 1 Phyllobacterium trifolii

Исследования методом ПЦР выявили у всех взятых в анализ штаммов наличие симбиотических генов, за исключением Phyllobacterium sp. из клубеньков Genista tinctoria.

Сопоставление филогении рибосомного и симбиотических генов показало, что в основном для полученных микросимбионтов характерно их совпадение, кроме минорного штамма 11В, полученного из клубенька Я. razoumowianum, который по последовательности гена 16S рРНК близок к Bradyrhizobium, но содержит ген иг/Я, имеющий гораздо большую гомологию с аналогичными генами, описанными у Mesorhizobium. Если учесть тот факт, что основными симбионтами у Я. razoumowianum, по нашим данным, являются бактерии рода Mesorhizobium, то можно предположить, что штамм 11В, возможно, приобрел симбиотические гены данных бактерий посредством горизонтального переноса

генов, что придало ему способность вступать в симбиоз с этим растением. У Phyllobacterium sp., выделенных из клубеньков Chamaecytisus ruthenicus, ген nifli имеют высокую гомологию с аналогичными генами Bradyrhizobium.

Делая обобщение, можно сказать, что состав исследованных микросимбионтов, взятых в анализ дикорастущих видов бобовых Южного Урала, оказался довольно разнообразным. Основное значение на таксономический состав микросимбионтов имеет вид растения-хозяина. Но в некоторых случаях прослеживается также влияние других факторов. В присутствии в клубеньках минорных видов ризобий у Caragana frutex и Genista tincloria четко прослеживается зависимость от условий произрастания растения-хозяина. Так, например, у Caragana frutex, произрастающей в степной зоне и. на южных склонах, в клубеньках были обнаружены бактерии Mesorhizobium sp. и Bradyrhizobium sp., ay растений, произрастающих в лесных и парковых зонах, где почва менее прогревается и более увлажнена -Mesorhizobium sp. и Rhizobium sp. Подобная картина наблюдается и у Genista tinctoria, у которой в прогреваемых почвах в клубеньках обнаруживаются только Bradyrhizobium sp., а в лесных зонах еще и Rhizobium sp. Данное явление, как мы предполагаем, связано с различной приспособленностью видов бактерий к разным почвенным условиям. Так, известно, что для большинства штаммов Rhizobium оптимальная температура наибольшей азотфиксирующей продуктивности в симбиозе с бобовыми растениями находится в пределах 24-26°С, а при повышении температуры > 30°С она резко снижается (Мишустин, Шильникова, 1973), что и является, скорее всего, причиной их отсутствия в клубеньках растений, произрастающих в прогреваемых сухих почвах.

Также в этом плане весьма интересны штаммы, относящиеся к Phyllobacterium sp. Данные бактерии, описанные впервые Knosel (1962), как бактерии, образующие клубенек-подобные структуры на листьях некоторых тропических растений, в клубеньках дикорастущих бобовых умеренного климата встречаются довольно часто (Mantelin et al., 2006; Valverde et al., 2005). Нами Phyllobacterium sp. были обнаружены в клубеньках всех взятых в анализ кустарниковых видов бобовых: Chamaecytisus ruthenicus, Caragana frutex, Caragana arborescens и Genista tincloria, а также в клубеньках двух травянистых видов бобовых: Onobrychis arenaria и Lathyrus gmelinii. Но, тем не менее, симбиотические гены были обнаружены не у всех исследованных штаммов данного вида. Так, не удалось обнаружить уут-гены методом ПНР с

использованием стандартных праймеров у штаммов, полученных из клубеньков Genista tinctoria, Caragana friitex и Onobiychis arenaria, а обнаруженные у других штаммов данные гены имели разное происхождение. У штамма С2А (Chamaecylisus ruthenicus), ген nifH имеет высокую гомологию с аналогичными генами, описанными у штаммов Bradyrhizobium, у бактерий из клубеньков Lalhyrus gmelinii nifH и nodA соответствовали таковым R. leguminosarum bv viceae. В работах некоторых авторов также не были обнаружены симбиотические гены у Phyllobacterium выделенных из клубеньков (Bromfield, 2020; Lei et al., 2008). Роль данных бактерий в симбиотических взаимоотношениях ризобий с бобовыми растениями остается неясной и является предметом дальнейших исследований.

Надо сказать, что любые вновь появившиеся рекомбинанты проходят через селектирующий отбор, который преодолевает лишь очень небольшая их часть, поскольку не любая трансмиссия симбиотических генов приводит к появлению эффективных и конкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий. Необходимо образование удачной комбинации вновь приобретенных sy/я-генов и имеющегося генетического фона. И для появления подобной комбинации порой необходим большой промежуток времени. По крайней мере, как нами было выявлено, у интродуцированных на территорию Южного Урала бобовых растений Galega orientalis (интродуцирован в 80-е годы прошлого века) и Caragana arborescens (в культуре с 1752 года) за время их произрастания в новых условиях изменений в составе клубеньковых бактерий еще не произошло. Хотя, например, у аборигенного родственного вида Caragana frutex состав симбионтов весьма разнообразен.

С другой стороны, в некоторых случаях даже малоэффективные рекомбинанты могут получить преимущество перед другими штаммами, если на них воздействует определенное селектирующее внешнее давление. Именно этим, скорее всего можно объяснить обнаружение нами у растений L vernus и L sylvestris, произрастающих на кислых почвах, бактерий R. tropici, которые более устойчивы к подобным условиям по сравнению R. leguminosarum -обычного симбионта бобовых трибы Vicieae.

Влияние окружающей среды как селектирующего фактора зачастую является определяющей. Так, например, штаммы, полученные нами из клубеньков растений, относящихся к трибам Galegeae и Hedysareae, в основном филогенетически близки к различным видам рода Mesorhizobium. Из

литературы известно, что растения Astragalus, Oxytropis и Hedysarum не являются строгими симбионтами и способны вступать в симбиоз со штаммами, относящимся к Mesorhizobium, Rhizobium, Ensifer (Sinorhizobium) и Bradyrhizobium (Han et al., 2008; Hou et al., 2009; Sui et al., 2009). Возможно, большую роль преимущественного симбиотического взаимодействия данных растений с бактериями рода Mesorhizobium в этом случае сьнрали условия произрастания растений, у которых были собраны клубеньки, характеризующиеся щебенистыми почвами и в основном на прогреваемых южных склонах. По видимому, Mesorhizobium более приспособлен к таким условиям существования. В пользу этого говорит и тот факт, что у A. wolgensis, выращенного из семян, собранных у растений, произрастающих в сходных с другими, растениями данного рода условиях, на покупном грунте все выделенные штаммы из клубеньков по последовательности 16S рРНК оказались близкородственны Ensifer (Sinorhizobium) meliloti, и к тому же на проверку успешно заражали Medicago sativa, у которого данные бактерии являются обычными симбионтами. Это говорит о более широком симбиотическом потенциале данных растений и значительном влиянии их условия произрастания и обсемененности почвы различными штаммами на их взаимоотношения с клубеньковыми бактериями.

Таким образом, в условиях Южного Урала ризобии Rhizobium leguminosarum являются основными симбионтами дикорастущих видов растений трибы Vicieae, Mesorhizobium — основными симбионтами дикорастущих видов растений трибы Galegeae, Hedysareae и вида Lotus ucrainicus, принадлежащего трибе Loteae, а ризобии рода Bradyrhizobium -дикорастущих видов трибы Genisteae. Кроме того, в зависимости от условий произрастания отдельные виды бобовых способны также вступать в симбиоз и с некоторыми другими видами клубеньковых бактерий.

Нужно отметить, что исследования ризобий дикорастущих бобовых растений — это ключ к пониманию и выявлению устоявшихся в течение тысячелетий в данных почвенно-климатических условиях симбиотических отношений между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями, которые, по сути, являются наиболее приспособленными и конкурентоспособными в данных условиях. И это, в свою очередь, может представлять огромный научный интерес, поскольку при исследовании разнообразия дикорастущих бобовых растений мы имеем возможность

«заглянуть в природный полигон», где постоянно проходят испытания различных вариантов штаммов клубеньковых бактерий, возникающих вследствие горизонтального переноса генов, что может служить полезным источником информации для понимания механизмов становления азотфиксирующего симбиоза. К тому же дикорастущие бобовые растения являются естественным поставщиком большого разнообразия штаммов клубеньковых бактерий, приспособленных к данным условиям окружающей среды для селекционных работ по поиску высокоэффективных и конкурентоспособных штаммов для выращивания бобовых растений, а также для ассоциативного симбиоза с небобовыми растениями в качестве ростстимулирующих бактерий, возможности которых были продемонстрированы многими авторами.

Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro. Для проведения визуальных исследований взаимодействия клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых с растениями и другими микроорганизмами, с использованием созданных нами маркерных векторов были получены штаммы клубеньковых бактерий, меченые разными флуоресцентными белками.

При создании векторных конструкций были использованы гены белков серии TurboColors: TurboGFP (Shagin et al., 2004) и TurboRFP (Merzlyak et al., 2007), отличающиеся улучшенными характеристиками по сравнению с первыми вариантами подобных белков. Векторные конструкции были созданы как для экспрессии гена маркерного белка с плазмиды, так и для встраивания его в состав хромосомы бактериальной клетки, поскольку у каждого из этих методов есть свои преимущества и недостатки. Для кратковременных экспериментов по исследованию свойств микроорганизмов, механизмов взаимодействия, конкурентоспособности и т.д., в которых основным требованием является неизменность фенотипа исследуемого штамма, более применима плазмидная экспрессия маркерного гена; для долгосрочных же экспериментов, где более важно устойчивое маркирование — желателен перенос и интеграция маркерного гена в состав хромосомы.

Первый набор, состоящий из векторов, обозначенных нами как pJNTurboGFP и pJNTurboRFP, был создан для плазмидной экспрессии маркерного гена. В качестве основы для конструкций была взята плазмида

широкого крута хозяев рЛМ105, содержащая репликон рЕВЮ. Уникальность данного репликона заключается в том, что он не принадлежит ни к одной из известных групп несовместимости.

Поскольку нами был обнаружен спонтанный переход /ио£>-содержащих маркирующих плазмид между некоторыми штаммами клубеньковых бактерий, в частности переход плазмиды был обнаружен между штаммами ВКВЬУ16.17 Р. ¡¿е^ттозагит, трансформированным рЛЧТигЬоСРР и штаммом ВКВЬРи14 А^оЬаМепит яр., трансформированным рЖТигЬоКРР, приведший к образованию клеток, содержащих как красный, так и зеленый флуоресцентные белки, выявленных методом проточной цитометрии (рис. 10), отоЬ-участки с данных конструкций были удалены сайт-направленным мутагенезом.

Рис. 10. Разделение популяций клеток ризобий методом проточной цитометрии. Нижний левый квадрант — дебрис, мертвые нефлуоресцирующие клетки, верхний левый квадрант — клетки штамма BKBLPul4 Agrobacterium sp„ содержащие RFP, нижний правый квадрант — клетки штамма BKBLV16.17 R. leguminosarurn, содержащие GFP, верхний правый квадрант — пул клеток, содержащий оба маркирующих белка. А — клетки, выращенные на жидкой питательной среде, Б — клетки, выращенные на твердой питательной среде.

Данные конструкции были обозначены как mob-: pJNTurboGFPmob- и pJNTurboRFPmob- (рис. 11).

С использованием данной серий векторов методом электропорации были успешно получены маркированные штаммы, относящиеся к различным родам клубеньковых бактерий: Rhizobium, Mesorhizobium, Ensifer (Sinorhizobium), Bradyrhizobium, Phyllobacterium и Agrobacterium-

содержащей ген ТиЛоОБР.

Для маркирования бактерий встраиванием гена флуоресцентного белка в состав хромосомы для долговременных экспериментов была модифицирована плазмида рКЬ765£ф, в которой ген под регуляцией промотора рзЬА, находящийся в составе транспозона Тп5, бьш заменен на гены флуоресцентных белков серии ТигЬоСо1огз под регуляцией конститутивного промотора фага Т5. Такие плазмиды были обозначены как рКЬ765ТигЬоОРР и р51Ъ765ТигЬоШ-Р (рис. 12).

Проведенная модификация заметно улучшила флуоресцентные характеристики меченных с использованием данных конструкций штаммов по сравнению с исходным рИЬ765§ф. Но, к сожалению, как и в случае рЫЬ765§1р, при использовании рКЬ765ТигЬоОРР и рЫЬ765ТигЬоКРР возникают проблемы с эффективностью трансформации. С применением данных конструкций нами были получены маркированные штаммы КЫгоЫит зр., РИуПоЬас(егшт Бр., Agrobacterium эр., где эффективность трансформации не превышала 1-5 колоний на 1 мкг трансформируемой ДНК. Трансформация же штаммов МезогЫгоЫит ер., Ет1/егьр., ВгафгНгоЫыт Бр. не увенчались успехом. Во всех случаях трансформацию проводили электропорацией.

Рис. 12. Схема модификации плазмиды pRL765gfp путем замены гена под регуляцией промотора рзЬА на ген ТигЬоОРР под регуляцией промотора фага Т5.

Исследование адгезии клеток ризобий ЯМъоЫит иттояагит Ьу. ушае на трансгенных по гену пектина рь1 бородатых корнях растений рапса и табака. Ризосфера растений не является структурно ограниченной симбиотической нишей и специфичность ее колонизации почвенными микробами относительно невелика. Однако состав ризосферной микрофлоры можно сделать гораздо более контролируемым, например, как предлагается нами, путем придания несимбиотрофным растениям способности синтезировать углеводсвязывающие белки (лектины), специфически адгезирутощие полезные азотфиксирующие микроорганизмы к их корням.

Лектины бобовых растений — секретируемые белки, способные узнавать и избирательно связывать разнообразные углеводы. Благодаря субъединичной структуре лектины являются би-(тетра-)валентными и тем самым способны избирательно связывать «свои» бактерии между собой и адгезировать их на поверхность корней бобовых растений, способствуя тем самым прикреплению клубеньковых бактерий к своему макросимбионту. Отсюда, трансгенные растения, синтезирующие лектины определенных бобовых растений, могут стать способными связывать микросимбионты к своим корням.

В качестве растительного объекта для подтверждения данной гипотезы

были выбраны несимбиотрофные виды растений табака (Nicotiana tabaccum) и рапса (Brassica napus L. var. napus), на которых с помощью вирулентного штамма Agrobacterium rhizogenes 15834, несущего бинарный вектор pCAMBIA 1305.1-рт/, были получены трансгенные по гену лектина гороха (psi), находящегося под управлением сильного CaMV-35S промотора, бородатые корни. Далее настоящие корни отрезали и получившиеся композитные, состоящие из нетрансгенной надземной части и трансгенных бородатых корней, растения высаживали на агровермикулит или грунт. Трансгенная природа корней была подтверждена активностью репортерного GUS-гена у 40% проростков. ПЦР анализ ДНК этих корней показал присутствие в них гена лектина и на уровне мРНК его конститутивную экспрессию (рис. 13). В качестве отрицательного контроля были использованы «бородатые корни», полученные с помощью исходного штамма А. rhizogenes 15834.

Рис. 13. Электрофореграмма ОТ-ПЦР-анализа экспрессии гена лектина в «бородатых корнях»: 1 -контроль на наличие ДНК в препарате мРНК, 2 -«бородатые корни», в которых идет экспрессия гена лектина, 3 — отрицательный контроль без генетического материала, 4 — продукт ПЦР на наличие гена лектина в «бородатых корнях», 5 — 1 КЬ ДНК маркер (250-10000 п.н.).

^трансформированные геном лектина гороха и контрольные (без этого гена) «бородатые корни» композитных растений рапса и табака были обработаны микросимбионтом гороха посевного R. leguminosarum 1078, предварительно трансформированным плазмидой pCAMBIA 1304 (несущей ген gus, способный экспрессироваться в бактериальных клетках), что позволяло легко идентифицировать бактерии по синему окрашиванию колоний, выросших на среде с X-Gluc. Определение количества адсорбированных ризобий через 1 час инкубации при комнатной температуре методом подсчета синих колоний, выросших на чашках Петри после рассева гомогената отмытых и растертых

корней, показало более чем на порядок увеличение численности бактерий на трансформированных геном ря1 корнях (в среднем = в 14 раз у табака и = в 37 раз у рапса), по сравнению с контрольными «бородатыми корнями» (количества адгезированных бактерий представлены в табл. 4 ). При этом был обнаружен достаточно большой разброс результатов опытов от растения к растению, связанный, скорее всего, с разным уровнем экспрессии гена лектина гороха в «бородатых корнях» (эффект положения гена является характерным недостатком трансгенов, введенных с помощью агробактериапьной трансформации).

Количество ризобий, адгезированных на поверхности «бородатых корней»

«Бородатые корни» Бактерии Количество бактерий, адгезированных на корешках, кл/г х 107 Повторностъ

Контрольные (без рб1) Я. ¡е^ттоватт 2,01-2,25 3,76-3,81 10

Опытные (Р81) 22,6-38,2 105-175

Известно, что в природе адсорбция ризобий на корневых волосках происходит за счет двойного специфичного связывания леюгина и с бактериями и с растительными клетками. Таким образом, на первом этапе бобово-ризобиального симбиоза бактерии колонизируют ризоплану растения-хозяина, в результате которой их численность в прикорневой зоне возрастает на 3-4 порядка (Купе е1 а. 1992). Проведенные нами эксперименты на трансгенных по гену лектина гороха корнях убедительно показывают возможность использования данных белков в качестве якорных молекул, способных сорбировать клубеньковые бактерии на поверхности корней несимбиотрофных растений.

Анализ специфичности взаимодействия лектинов бобовых растений с клубеньковыми бактериями. При создании искусственных ассоциаций важным моментом является обеспечение специфичности взаимодействия

полученных трансгенных растений с бактериями, оказывающими на них благоприятное воздействие. С этой точки зрения использование лектинов бобовых для прикрепления ризобий на поверхность корней является оптимальным решением, поскольку данные белки обладают достаточно высокой избирательностью к углеводам и участвуют в специфичном узнавания макро- и микросимбионтов на начальных стадиях образования симбиоза.

Лекгины бобовых растений, взаимодействуя с углеводными остатками на поверхности клеточной стенки клубеньковых бактерий, участвуют в их прикреплении к клеткам эпидермиса корней и способны вызвать агглютинацию бактерий. Это свойство было выбрано нами для проверки специфичности взаимодействия данного класса белков с различными видами ризобий.

В качестве объектов для исследования были выбраны лекгины из семян козлятника восточного (Galega orientalis) и гороха посевного (Pisum sativum), а также обычные симбионты данных растений R. galegae и R. leguminosarum bv. Viciae, соответственно. Выбор данных пар был продиктован с одной стороны строгой специфичностью при взаимодействии этих растений со своими микросимбионтами, с другой — относительной филогенетической близостью микросимбионтов, относящихся к одному роду.

В работе были использованы штамм CIAM 0702 R. galegae (симбионт козлятника восточного) и штамм CIAM 1078 R. leguminosarum bv. viciae (симбионт гороха). Оба штамма для удобства детектирования были трансформированы плазмидой pJNTurboRFPmob- для маркирования их красным флуоресцентным белком. В качестве лектина гороха был использован коммерческий препарат PSL (Serva, Германия), а лектин козлятника восточного (GOL) ввиду отсутствия коммерчески доступного препарата белка был выделен из семян растения. В качестве контроля использовали коммерческий препарат лектина FHA из семян фасоли (Serva, Германия).

При визуальном анализе клеток при помощи флуоресцентного микроскопа после 8 часов инкубации было обнаружено, что клетки каждого из исследуемых штаммов агглютинируют только при обработке лектином растений, к которым специфичен данный вид ризобий (рис. 14). При перекрестной же обработке или при воздействии FHA агрегации не происходило. Таким образом, можно

сделать вывод, что лектины из семян гороха посевного и козлятника восточного имеют высокую специфичность при взаимодействии с микросимбионтами своих растений.

Рис. 14. Агглютинация ризобий лекгинами из семян бобовых растений.

A. R. leguminosarum bv. viciae + PSL; Б. R leguminosarum bv. viciae + GOL;

B. R. galegae + GOL; Г. R galegae + PSL;

Следовательно, лектины бобовых растений, обладающих высокой избирательностью симбиоза со своими ризобиями, могут стать удачным инструментом для создания строго контролируемых искусственных ассоциаций растений с клубеньковыми бактериями.

Создание искусственных ассоциативных симбиозов с помощью лектинов на примере трансгенных растений табака и бородатых корней томата и рапса. Для проверки возможности получения стабильных искусственных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями в естественных условиях, нами были получены полностью трансгенные по гену psl лектина гороха растения табака, а также композитные (с трансгенными по гену psl корнями) растения томата и рапса, (рис. 15).

В качестве микросимбионтов для инокуляции были использованы перекрестно не заражающие виды ризобий R. leguminosarum bv. viciae 1078 и R. galegae CIAM 0702, которые для удобства детектирования были маркированы разными флуоресцентными белками.

Рис. 15. растений

Выращенные в течение месяца на грунте за счет трансгенных бородатых корней композитные растения томата и рапса, а также месячные растения табака заражали культурами клубеньковых бактерий Я. 1е%итто$агит Ьу. уюте 1078 (ТигЬоКРР) и К galegae 0702 (ТигЬоСРР) по отдельности каждое растение и в смеси. Для этого к корневой системе растений добавляли 5 мл суспензии клеток в концентрации 1000 КОЕ/мл и оставляли на ночь, после чего проводили подсчеты сорбировавшихся клеток. Полученные данные наглядно показали влияние трансгенного лектина на взаимодействие растений с бактериями, поскольку на трансгенных по р$1+ корнях адгезировалось значительно больше клеток Я. 1е2рттозагит Ьу. \-iciae по сравнению с контрольными растениями, как в случае полностью трансгенного табака, так и на трансгенных корнях композитных растений. Более того, взаимодействие бактерий с корнями растений было строго специфичным, поскольку количество адгезированных клеток К galegae как на />$/+, так и на /и7- корнях опытных растений достоверно не отличалось, и было примерно равно количеству клеток Я. leguminosarгlm Ьу. уг’с/ае, прикрепившихся наряЬ корнях (рис. 16).

При визуальном анализе с помощью флуоресцентной микроскопии также была обнаружена специфическая колонизация Я. leguminosarum Ьу. хшае поверхности корней (преимущественно корневых волосков) именно /м7+ растений. На р.ч1- корнях всех видов растений явной колонизации обнаружено не было.

Гистохимический анализ ОШ-активности корней композитных томата (А), рапса (Б) и трансгенного растения табака (В).

Количество вдгезироваиных на поверхности трансгенных «бородатых корней» рнзобий, КОЕ/г *10«

Н.1. — я, /едитюозагит

я-д- ял. я-я, В>1, \ ял, я^». | ял. |я.д-

Рис. 16. Количество клеток Я. 1е^т1гю$агит Ьу. мШае и К galegae, адгезированных на поверхности корней опытных (ря1+) и контрольных (ря1-) растений табака, томата и рапса.

Схожая картина наблюдалась и при совместной инокуляции Л \eguminosarum Ьу. тс1ае и Л galegae (рис. 17).

Рис. 17. Совместная инокуляция К leguminosarum Ьу, у/’сг’ае (ТигЬоКГ’Р -красный) и К. ga¡egae (ТигЬоОРР — зеленый) р.ч1+ трансгенных корней опытных растений. А — рапс, Б — томат, В — табак.

Кроме прочего, наблюдается также влияние трансгенного белка на симбиотические реакции корневых волосков табака при обработке

К legllminosarum Ьу. уШае. После инокуляции корней растений этим микросимбионтом с помощью микроскопирования были выявлены

немногочисленные скручивания корневых волосков, которых не наблюдалось в случае обработки данными бактериями контрольных растений без гена лектина (рис. 18).

Рис. 18. Скручивания корневых волосков/?$/+ трансгенного табака при взаимодействии с К ¡е^ттозагит Ьу. у/сше

Наконец, в пользу того, что именно лектин является заякоривающим агентом, говорит то, что клетки К. ¡е^ттояагит Ьу. \4ciae в начальной фазе прикрепления располагаются, как видно на рис. 19, перпендикулярно поверхности корня рз1+ трансгенного табака.

Рис. 19. Начальная фаза прикрепления клеток К ^иттохагит Ьу. \iciae (СЕР) к поверхности корня р$!+ трансгенного табака.

Дело в том, что у данного вида бактерий полисахариды, которые участвуют во взаимодействии бактериальной клетки с лектином, расположены

именно на полюсах клеток. Карбогидратный анализ показал, что эти полисахариды на 95% состоят из остатков маннозы и глюкозы. Именно за счет них происходит взаимодействие бактериальных клеток с лектинами на поверхности корня гороха, что и является причиной первичного прикрепления бактерий к корням одним из полюсов. При этом данный признак не связан с симбиотическими генами и кодирован на хромосоме, что делает наличие данных полисахаридов видовым признаком, не зависящим от состава плазмид (Laus, 2006).

Обобщая вышесказанное, можно отметить, что: во-первых, очевидно участие лектина в прикреплении клубеньковых бактерий к поверхности трансгенных корней; во-вторых, взаимодействие лектинов и ризобий на поверхности трансгенных корней имеют специфический характер; в-третьих, колонизация трансгенных по гену лектина корней специфичными ризобиями успешно происходит и в условиях грунта, где существует конкуренция с другими почвенными микроорганизмами. Таким образом, становится очевидным, что лектин может служить якорным белком для специфичного направленного прикрепления определенных полезных бактерий к корням трансгенных по гену данного белка растений.

Таким образом, было изолировано и генетически охарактеризовано более 1200 штаммов клубеньковых бактерий из клубеньков 36 видов дикорастущих бобовых растений Южного Урала принадлежащих 12 родам. Были получены сведения об их генетическом разнообразии и филогенетической принадлежности 65-ти нуклеотидных последовательности генов 16S рРНК штаммов клубеньковых бактерий и зарегистрированы в международных банках данных EMBL/GenBank/DDBJ.

Получены данные о влиянии горизонтального переноса симбиотических генов на изменение состава клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений.

Создана серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, предназначенных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий.

Это векторы на основе репликона широкого круга хозяев pBBRI для маркирования штаммов, экспрессирующих маркерный ген с трансформируемой плазмиды и векторы на основе плазмиды pRL765gfp для маркирования штаммов путем введения генов флуоресцентных белков в состав хромосомы бактерий.

Получены данные о возможности использования генов лектинов бобовых растений в качестве трансгенов для создания искусственных ассоциаций клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями.

Показано, что ризобии могут быть использованы не только в качестве инокулянтов при выращивании бобовых растений, но и для создания новых ассоциаций с несимбиотрофными растениями. Применение стратегии конструирования «искусственной ризосферы», специфически колонизируемой только теми микробами, которые выполняют полезные для растений трофические, ростостимулирующие и/или защитные функции, с использованием лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, может стать важным шагом к получению стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями.

1. Собрана и генетически охарактеризована коллекция клубеньковых бактерий 36 видов дикорастущих бобовых растений Южного Урала, относящихся к 12 родам, состоящая из 1217 штаммов.

2. Обнаружена высокая полиморфность ДНК бактерий, вступающих в симбиоз с бобовыми растениями трибы Vicieae. Коэффициент гетерогенности Шеннона у исследованных штаммов составил от 0,32 для ризобий чины Литвинова до 0,82 для ризобий чины клубненосной. Показано, что их гетерогенность вызвана различиями в плазмидном составе, что говорит о высокой рекомбинационной активности данных бактерий.

3. У четырех видов рода Lathyrus в клубеньках обнаружены микросимбионты, которые считались для них несвойственными (I. vernus и L. sylvestris -R. tropici, L. palustris — Agrobacterium sp., L. gmelinii — Phyllobacterium sp.).

4. Выявлено, что симбиогические гены (иг/77, nifD и nodA) штаммов R. tropici и Agrobacterium sp., образующих клубеньки на корнях видов Lathyrus, имеют

высокую степень гомологии с аналогичными симбиотическими генами R. leguminosarum bv. Viciae, что свидетельствуют в пользу того, что данные штаммы получили sym гены от R. leguminosarum bv. viciae путем горизонтального переноса генов.

5. Идентичность состава микросимбионтов у караганы древовидной, произрастающей как на Южном Урале, так и в Китае, указывает на высокую специфичность взаимодействия этого вида растения со своими ризобиями.

6. Показано, что на территории Южного Урала основными симбионтами растений трибы Genisteae являются бактерии рода Bradyrhizobium, растений подтрибы Astragalinae трибы Galegeae и растений трибы Hedysareae -бактерии рода Mesorhizobium.

7. Созданы плазмидные конструкции для флуоресцентного мечения клубеньковых бактерий и получены их маркированные штаммы с генами TurboGFP и TurboRFP как с экспрессией маркерного гена с трансформированной плазмиды, так и с переводом его в состав хромосомы бактерий. Показана необходимость отсутствия mob участка в составе маркирующих плазмид во избежание спонтанной их передачи другим почвенным бактериям с помощью конъюгации.

8. Выявлено, что пластичность при выборе L. vernus, L. palustris и L. gmelinii «своих» микросимбионтов может быть обусловлена наличием у этих растений нескольких изоформ лектина.

9. Увеличение адсорбции ризобий на поверхности трансгенных по гену лектина гороха psl бородатых корней рапса и табака подтверждает участие данного белка в прикреплении бактерий к клеткам эпителия трансгенного корня.

10.Экспрессия гена лектина гороха psl способствует избирательной колонизации ризосферы табака, рапса и томата ризобиями R. leguminosarum bv. viciae в условиях конкуренции с посторонней микрофлорой. Это может быть использовано для получения стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с азотфиксирующими бактериями.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Баймиев Ал.Х., Чемерис A.B., Баймиев Ан.Х., Вахитов В.А. Углеводсвязывающие пептиды лектинов бобовых растений в связи с различной хозяйской специфичностью макросимбионта при образовании симбиоза с клубеньковыми бактериями // Генетика. 2001. Т. 37, № 2. С. 215222.

2. Губайдуллин И.И., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х., Чемерис A.B., Вахитов В.А. Синтезированный в E.coli лектин гороха посевного (psl) способен инициировать клубенькообразование на люцерне посевной при ее инокуляции Rhizobium leguminosarum bv. viciae II Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. 2006. Т. 2, № 2. С. 11-16.

3. Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Баймиев Ан.Х., Чемерис A.B., Баймиев Х.М., Вахитов В.А. Симбиоз козлятника восточного с клубеньковыми бактериями Rhizobium galegae: специфичность и конкурентоспособность // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т. 43, №3. С. 311-317.

4. Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х., Губайдуллин И.И., Куликова O.JL, Чемерис A.B. Филогения и генетическое разнообразие клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с астрагалом нутовым // Микробиология. 2007. Т. 76, №1. С. 129-131.

5. Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х., Губайдуллин И.И., Куликова O.JL, Чемерис A.B. В клубеньках эспарцета песчаного обнаружены бактерии, близкие по гену 16S рРНК к Phyllobacterium trifolii // Генетика. 2007. Т. 43, № 5. С. 716719.

6. Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Баймиев Ан.Х., Чемерис A.B. Сайт-направленный мутагенез углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений с использованием инвертированной ПЦР // Молекулярная биология. 2007. Т. 41, № 5. С. 940-942.

7. Баймиев Ал.Х, Губайдуллин И.И., Баймиев Ан.Х., Чемерис A.B. Влияние природных и гибридных лектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45, № 1. С. 8491.

8. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Баймиев Ал.Х. Влияние интродукции караганы древовидной на состав ее клубеньковых бактерий // Микробиология. 2020. Т. 79, №1. С. 123-128.

9. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Благова Д.К., Мулдашев A.A., Баймиев Ал.Х. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с чиной весенней Lathyrus vemus (L.) Bernh. // Микробиология. 2020. Т. 80, № 1. С. 100-104.

10.Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Мулдашев A.A., Баймиев Ал.Х. Генетическая характеристика клубеньковых бактерий бобовых рода Lathyrus L. (Fabaceae), произрастающих на территории Республики Башкортостан // Экологическая генетика. 2020. № 2. С. 3-8.

П.Вершинина З.Р., Баймиев Ан.Х., Благова Д.К., Князев A.B., Баймиев Ал.Х., Чемерис A.B. Биоинженерия симбиотических систем: создание новых

ассоциативных симбиозов с помощью лектинов на примере табака и рапса // Прикладная биохимия и микробиология. 2020. Т. 47, № 3. С. 336-342.

12.Баймиев Ан.Х., Ямиданов P.C., Матниязов Р.Т., Благова Д.К., Баймиев Ал.Х., Чемерис A.B. Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro //Молекулярная биология. 2020. Т. 45, № 6. С. 984-991.

13.Чубукова О.В., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х. Полиморфизм генов лектинов растений рода Lathyrus // Генетика. 2020. Т. 47, № 7. С. 920-926.

М.Баймиев Ан.Х., Иванова Е.С., Птицын К.Г., Чубукова О.В., Баймиев Ал.Х. Филогенетический анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий растений рода Lathyrus (L.) (Fabaceae) II Молекулярная генетика, микробиолгия и вирусология. 2020. № 4. С. 14-17.

15.Иванова Е. С., Баймиев Ан. X., Ибрагимов Р. И., Баймиев Ал. X. Симбиотические гены клубеньковых бактерий и влияние их горизонтального переноса на видовой состав микросимбионтов бобовых растений // Вестник Башкирского университета. 2020. Т. 16, № 4. С. 1050-1054.

16.Баймиев Ан.Х., Иванова Е.С., Птицын К.Г., Белимов A.A., Сафронова В.И., Баймиев Ал.Х. Генетическая характеристика клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых Южного Урала // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020. № 1. С. 29-34.

17.Вершинина З.Р., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Лектаны бобовых растений как инструмент для создания новых симбиотических систем. Germany: Lambert Academic Publishers, 2020.140 С.

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ И СТАТЬИ В СБОРНИКАХ КОНФЕРЕНЦИЙ

18.Губайдуллин И.И., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х. Получение лектинов с измененной углеводспецифичностью. // Международная школа-конференция молодых ученых «БИОТЕХНОЛОГИЯ БУДУЩЕГО». Санкт-Петербург. 2006. С. 23-24.

19.Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х., Губайдуллин И.И., Чемерис A.B. Клубеньковые бактерии астрагала нутового и эспарцета песчаного: генетическое разнообразие и филогенетическое положение // Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва. 2006. С. 12.

20.Баймиев Ан. X., Баймиев Ал. X., Птицын К.Г., Чемерис A.B. Генетическая гетерогенность ризобий, вступающих в симбиоз с дроком красильным и караганой древовидной // Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва. 2006. С. 11.

21.Губайдуллин И.И., Баймиев Ал. X., Баймиев Ан. X. Различия в углеводсвязывающих пептидах лектинов клеверов Trifolium repens, Т. pratense, Т. trichocephalum, инокулирующихся сходными ризобиальными штаммами // Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Москва. 2006. С. 56.

22.Губайдуллин И.И., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х. Экзогенная обработка гибридными лектинами способна расширять круг перекрестной инокуляции бобовых растений ризобиями // Ш Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов. 2006 г. С. 24.

23.Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х., Вершинина З.Р., Куликова O.JI. Генетическое биоразнообразие популяций ризобий Sinorhizobium meliloli, вступающих в симбиоз с бобовыми родов Medicago и Melilotus произрастающих в Башкортостане // Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С. И. Алиханяна. Москва. 2006. С. 36-37.

24.Баймиев Ан.Х., Бурмистрова JI.E., Птицын К.Г. Филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с караганой кустарниковой (Caragana frutex) и караганой древовидной (Caragana arborescens). // Школа-конференция молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика — наука XXI века». Уфа. 2007. С. 810.

25.Бурмистрова JI.E., Баймиев Ан. X. Генетическое биоразнообразие клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с вязелем разноцветным (Coronilla varia) II Школа-конференция молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика — наука XXI века». Уфа. 2007. С. 12-13.

26.Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х. Определение филогении ризобиальных бактерий, вступающих в симбиоз с горошком заборным (Vicia sepium) // Школа-конференция молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика — наука XXI века». Уфа. 2007. С. 8-10.

27.Баймиев Ан.Х., Бурмистрова Л.Е., Гареев А. Симбиотические отношения караганы кустарниковой с клубеньковыми бактериями являются малоспецифичными. // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем». Саратов. 2007. С. 74

28.Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал. X. Генетическая гетерогенность и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими растениями рода чина (Lathyrus), произрастающими на территории Республики Башкортостан // V Всероссийская конференция молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов. 2020. С. 29.

29.Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Генетическая гетерогенность клубеньковых бактерий вступающих в симбиоз с чиной бледноватой (Lathyrus pallescens (Bieb.) C.Koch) // 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология — наука XXI века». Пущино. 2020. С. 255.

30.Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Благова Д.К., Баймиев Ал.Х. Изменение

видового состава клубеньковых бактерий чины весенней Lathyrus vernus (L.) Bemh и чины лесной Lathyrus sylvestris L. в зависимости от почвенно-климатических условий // Всероссийский симпозиум «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)». Москва. 2020. С. 44-45.

31.Халитова JI.X., Баймиев А.Х. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей некоторых симбиотических генов штаммов клубеньковых бактерий, нодулирующих чину весеннюю Lathyrus vermis(L.) Bemh II V Всероссийская конференция молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов. 2020. С. 31.

32.Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Баймиев Ал.Х. Влияние почвенно-климатических условий на состав клубеньковых бактерий Genista tinctoria и Caragana frutex (Fabaceae) // VI Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». Нижний Новгород. 2020. С. 64-65.

33.Благойа Д.К., Баймиев А.Х. Плазмидный состав штаммов клубеньковых бактерий, нодулирующих чину весеннюю Lathyrus vernus (L.) Bernh II V Всероссийская конференция молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов. 2020. С. 21.

34.Чубукова О.В., Баймиев Ал.Х., Баймиев Ан.Х. Полиморфизм генов лектинов растений трибы Galegeae, различных групп перекрестной инокуляции. // VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий». Нижний Новгород. 2020. С. 749-750.

1111 — горизонтальный перенос генов GFP — зеленый флуоресцентный белок RFP — красный флуоресцентный белок УСП — углевод связывающий пептид FHA — лектин Phaseolus vulgaris PSL — лектин Pisum sativum GOL — лектин Galega orientalis

RAPD -произвольная амплификация полиморфной ДНК ПДРФ (RFLP)- полиморфизм длины рестриктазных фрагментов

Подписано в печать 30.01.12 г. Формат 60×84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 604. Гарнитура «Тше8№\уКотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1,5 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Баймиев, Андрей Ханифович

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Систематика клубеньковых бактерий

1.1. Становление систематики клубеньковых бактерий

1.2. Современное состояние систематики клубеньковых бактерий

1.4. Новые ризобии

Глава 2. Геномы клубеньковых бактерий

2.1. Организация генома клубеньковых бактерий

2.2. Горизонтальный перенос генов

2.3. Передача сигналов в симбиозах

Глава 3. Роль лектинов в азотфиксирующем симбиозе

3.1. Общая характеристика лектинов растений

3.2. Лектины бобовых растений

3.3. Функции лектинов в азотфиксирующем симбиозе

Глава 4. Создание искусственных ассоциаций

4.1. «Бородатые корни» как модель корневой системы в 76 симбиотических взаимодействиях

4.2. Биоинженерия симбиотических систем

4.3. Ассоциации ризобий с небобовыми растениями

4.4. Благоприятное воздействие ризобий на небобовые растения

4.4.1. Механизмы прямого воздействия

4.4.2. Механизмы опосредованного воздействия

Глава 5. Прижизненное маркирование клеток клубеньковых бактерий

5.1. Флуоресцентные белки

ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 6. Объекты исследований

6.1. Краткая характеристика объектов исследований

Глава 7. Методы исследований

7.1. Схема анализа клубеньковых бактерий

7.1.1. Сбор клубеньков бобовых растений.

7.1.2. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий.

7.1.3. Схема генетического анализа клубеньковых бактерий.

7.1.4. Хранение штаммов ризобий

7.2. Выделение и очистка ДНК ризобий

7.3. Полимеразная цепная реакция

7.4. Кластерный анализ RAPD профилей

7.5. Выделение и электрофоретическое разделение мегаплазмидной 106 ДНК ризобий

7.6. Секвенирование ДНК на автоматическом секвенаторе

7.7. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

7.8. Выделение и очистка ДНК растений

7.9. Выделение и очистка РНК растений

7.10. Синтез кДНК

7.11. Выделение и очистка плазмидной ДНК E.coli

7.12. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами

7.13. Аналитический гель-электрофорез ДНК в не денатурирующих 115 условиях

7.14. Препаративный гель-электрофорез ДНК

7.15. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных гелей

7.16. Обработка ДНК щелочной фосфатазой и полинуклеотидкиназой фага Т4.

7.17. Сайт направленный мутагенез

7.18. Подготовка химически компетентных клеток Е. coli

7.19. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК

7.20. Подготовка электрокомпетентных клеток E.coli.

7.21. Подготовка электрокомпетентных клеток клубеньковых 124 бактерий и лабораторных штаммов Agrobacterium tumefaciens

7.22. Электропорация компетентных клеток ризобий

7.23. Стерилизация и проращивание семян рапса

7.24. Получение «бородатых корней» и композитных растений рапса.

7.25. Агробактериальная трансформация листовых пластинок табака

7.26. Анализ ß-глюкуронидазной (gus) активности

7.27. Обработка бородатых корней микросимбионтом R. leguminosarum и подсчет количества адсорбированных на поверхности корней ризобий

7.28. Создание полностью трансгенных по гену лектина PSL 130 растений табака

7.29. Выделение семенного лектина козлятника восточного

7.30. Определение кислотности почвы

7.31. Подсчет количества флуоресцентно меченых клеток

Глава 8. Реактивы и материалы

8.1. Бактериальные штаммы для молекулярно-биологических манипуляций, плазмидные и фагмидные векторы

8.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении

ПЦР и сайт-направленного мутагенеза

8.3. Реактивы и материалы

8.4. Составы использованных стандартных растворов 138 ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 9. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими растениями умеренного климата

9.1. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий 140 бобовых трибы Vicieae

9.2. Исследование закономерности распределения генотипов 146 филогенетически однородных бактерий Rhizobium leguminosarum в клубеньках отдельной популяции растений Lathyrus vernus.

9.3. Исследование влияния горизонтального переноса генов на 151 видовой состав клубеньковых бактерий растений рода Lathyrus

9.4. Исследование структуры генов лектинов растений L. vernus, L. 156 palustris и L. gmelinii.

9.5. Исследование эффективности штаммов R. tropici, Agrobacterium 165 sp. и Phyllobacterium sp., обнаруженных в клубеньках растений рода Lathyrus

9.6. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий 168 трибы Galegeae

9.7. Влияние интродукции Galega orientalis на состав ее симбионтов

9.8. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий 177 трибы Loteae, Genisteae и Hedysareae.

9.9. Обобщение по главе

Глава 10. Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro

Глава 11. Создание искусственных ассоциаций клубеньковых бактерий с небобовыми растениями.

11.1. Создание новых ассоциативных симбиозов с помощью 201 лектинов на примере трансгенных бородатых корней табака и рапса

11.2. Клонирование гена лектина в бинарном векторе pCambia 204 1305.

11.3. Получение «бородатых корней» на рапсе и листовых пластинках табака

11.4. Исследование адгезии клеток ризобий Rhizobium leguminosarum 209 bv. viciae на трансгенных по гену лектина PSL бородатых корнях растений рапса и табака.

11.5. Анализ специфичности взаимодействия лектинов бобовых 211 растений с клубеньковыми бактериями.

11.6. Создание искусственных ассоциативных симбиозов с помощью 215 лектинов на примере трансгенных растений табака и бородатых корней томата и рапса.

Введение Диссертация по биологии, на тему «Клубеньковые бактерии дикорастущих бобовых растений Южного Урала и молекулярное конструирование их искусственных ассоциаций с небобовыми растениями»

Актуальность темы. Клубеньковые бактерии (ризобии) — обширная, генетически разнородная группа почвенных грамотрицательных микроорганизмов, способных вступать во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и обеспечивать фиксацию атмосферного азота.

Интерес к этим бактериям со стороны исследователей связан, с одной стороны, сельскохозяйственной значимостью симбиотической азотфиксации и необходимостью разработки генетических методов селекции и конструирования хозяйственно-ценных штаммов ризобий, инокуляция которыми позволит получить высокие урожаи бобовых культур без использования дорогостоящих и экологически небезопасных азотных удобрений (Симаров, 1990; Борисов и др., 2007), а с другой — использованием клубеньковых бактерий как модельного объекта для изучения биологии взаимодействия микроорганизмов с высшими растениями, генетического контроля и эволюции симбиотических систем (Онищук, 1995; Проворов, 2000; Рапшке, 2008).

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является исследование генетических ресурсов клубеньковых бактерий, особенно естественных природных популяций, где наиболее эффективным подходом для этих исследований является анализ их генетического разнообразия, результатом которого может быть понимание процессов возникновения новых генотипов за счет мутаций, рекомбинаций, горизонтального переноса генов. В настоящее время для характеристики ризобий широко используются различные молекулярно-генетические методы. Преимущество этих методов состоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики, независящие от физиологического статуса микроорганизма.

Значение таких исследований велико, поскольку они могут позволить выявить наиболее удачные комбинации геномов ризобий, которые могут быть использованы в качестве основы для направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для практики.

Рациональное использование свойств аборигенных популяций ризобий, в перспективе, несомненно, является важным элементом биологизации земледелия и создания адаптивно-интенсивной стратегии растениеводства не только бобовых культур, но за счет использования ассоциативного симбиоза и других сельскохозяйственно-значимых растений.

Создание искусственных азотфиксирующих ассоциаций культурных растений с эндофитными микроорганизмами, которые выделены из природных симбиозов, является относительно новым направлением в биоинженерии симбиотических систем. Клубеньковые бактерии рода Rhizobium, фиксирующие азот в симбиозе с бобовыми растениями, могут также выступать и в качестве ассоциативных микросимбионтов для многих экономически ценных небобовых культур, таких как рис, кукуруза, пшеница, рапс, подсолнечник и т. д. Эти бактерии способны колонизировать корневую систему и повышать урожайность растений, выделяя ростостимулирующие вещества и защищая от фитопатогенов. Как показали исследования последних лет, ризобии принимают активное участие в усвоении растениями труднорастворимых соединений фосфора и даже, проникая в надземную часть растения, могут усиливать процесс фотосинтеза. (Chi et al., 2005; Черемных и др., 2007; Perrine-Walker et al., 2007). Поэтому получение искусственных симбиотических ассоциаций этих бактерий является одним из наиболее перспективных направлений на пути создания экологически ориентированного сельского хозяйства. На сегодняшний день уже выделены штаммы Rhizobium, которые успешно колонизируют в природе корни небобовых растений. Например, показано, что наиболее перспективными штаммами для создания азотфиксирующих ассоциаций риса являются ризобии клевера R. leguminosarum bv. trifolii R4 (Perrine-Walker, 2007), так как эти бактерии способны колонизировать корни и заселять межклетники, способствуя увеличению урожая. В случае кукурузы и латука в качестве подобного штамма можно использовать ризобии фасоли R. leguminosarum bv. phaseoli Р31 и R1, которые успешно колонизируют корни этих растений в почве (Chabot, 1996)

Вместе с тем, следует отметить, что эти процессы неконтролируемы, и в естественных условиях, к сожалению, ризосферные бактерии с полезными признаками не выдерживают конкуренции и вытесняются более агрессивными бактериями, зачастую обладающими фитопатогенными свойствами. Задача исследователей состоит в том, чтобы придать растениям способность контролировать микрофлору своей ризосферы.

Лектины бобовых растений — секретируемые белки, способные узнавать и избирательно связывать разнообразные углеводы. Благодаря субъединичной структуре лектины являются би-(тетра-)валентными и тем самым способны избирательно связывать «свои» бактерии между собой и адгезировать их на поверхность корней бобовых растений, способствуя тем самым прикреплению клубеньковых бактерий к своему макросимбионту. Отсюда, трансгенные растения, синтезирующие лектины определенных бобовых растений, станут способны связывать их микросимбионтов к своим корням.

Применение подобной стратегии дает ключ к конструированию «искусственной ризосферы», специфически колонизируемой только теми микробами, которые выполняют полезные для растений трофические, ростостимулирующие и/или защитные функции, а использование лектинов бобовых растений в качестве трансгенов может стать важным шагом к получению стабильных ассоциаций экономически ценных несимбиотрофных видов растений с ризобиями.

Цель работы заключалась в исследовании генетического разнообразия и филогении клубеньковых бактерий дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала и разработке подходов для использования биологического потенциала данных бактерий при культивировании небобовых хозяйственно-ценных растений.

1. Собрать коллекцию штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала, проанализировать их генетическое разнообразие и определить филогенетическое положение.

2. С целью выявления возможности влияния горизонтального переноса генов на видовое разнообразие микросимбионтов исследованных растений провести филогенетический анализ симбиотических и 16S рибосомных генов.

3. Создать плазмидные конструкции для мечения клубеньковых бактерий флуоресцентными белками и получить маркированные штаммы для их детекции in vivo и in vitro.

4. Провести анализ полиморфизма генов лектинов представителей рода Lathyrus, вступающих в симбиоз с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae.

5. Оценить специфичность взаимодействия лектинов из семян гороха посевного и козлятника восточного с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae и Rhizobium galegae.

6. Исследовать возможность адгезии клеток ризобий Rhizobium leguminosarum bv. viciae на контрольных и трансгенных по гену лектина psl бородатых корнях растений рапса и табака.

7. На модельных растениях трансгенного табака и композитных растений томата и рапса изучить возможность специфичной колонизации их ризосферы целевым видом клубеньковых бактерий в условиях конкуренции с почвенной микрофлорой.

Научная новизна. Изолировано более 1200 штаммов ризобий из клубеньков 36-ти видов дикорастущих бобовых растений, относящихся к 12-ти родам. Исследовано их генетическое разнообразие и на основе сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК определено их филогенетическое положение.

Выявлено, что для штаммов ризобий, выделенных из клубеньков дикорастущих видов растений трибы Vicieae, которые по последовательности генов 16S рРНК за небольшим исключением относятся к виду Rhizobium leguminosarum, характерна высокая степень генетической гетерогенности, обусловленная различиями в их плазмидном составе, вызванная, предположительно, высокой трансмиссивностью мобильной части их генома. С помощью кластерного анализа RAPD-фингерпринтов данных штаммов обнаружено, что внутри популяции клубеньковых бактерий существует разделение на субпопуляции, рекомбинационные процессы между которыми имеют определенные ограничения.

Несмотря на то, что почти все исследованные штаммы, вступающие в симбиоз с растениями трибы Vicieae, относились к Rhizobium leguminosarum, у некоторых видов растений рода Lathyrus в клубеньках были обнаружены бактерии, не являющиеся типичными симбионтами для этих растений. Так, в клубеньках у L. vernus и L. sylvestris идентифицированы ризобии, близкие к R. tropici, у L. palustris — бактерии, близкие к Agrobacterium sp., а у L. gmelinii — к Phyllobacterium sp. Выявлено, что симбиотические гены данных артефактных бактерий имеют филогенетическое родство с аналогичными генами, ранее описанными у бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae, что, скорее всего, и является причиной изменения их специфичности.

Показано, что основными симбионтами дикорастущих видов бобовых растений подтрибы Astragalinae трибы Galegeae в условиях Южного Урала являются бактерии рода Mesorhizobium, хотя некоторые виды растений данной подтрибы в зависимости от почвенно-климатических условий способны вступать в симбиоз и с представителями других родов ризобий, таких как Rhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer. Для растений трибы Genisteae характерно преобладание в клубеньках бактерий рода Bradyrhizobium, для растений трибы Hedysareae — Mesorhizobium. Все полученные из клубеньков растений Coronilla varia (триба Loteae) штаммы бактерий по последовательности генов 16S рРНК оказались близки к бактериям Rhizobium leguminosarum.

У штамма ризобии, изолированного из клубенька H. razoumowianum, близкого по последовательности гена 16S рРНК к Bradyrhizobium, обнаружен ген niflí, имеющий заметно большую гомологию с аналогичными генами, описанными у Mesorhizobium, что может служить аргументом в пользу горизонтального переноса симбиотических генов.

Создана серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, предназначенных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий. Векторы на основе репликона широкого круга хозяев pBBRJ предназначены для мечения штаммов с экспрессией маркерного гена с трансформируемой плазмиды, а векторы на основе плазмиды pRL765gfp созданы для маркирования штаммов путем введения генов флуоресцентных белков в состав хромосомы бактерий.

Показано, что для переноса конструкций в клетки клубеньковых бактерий наиболее предпочтителен метод трансформации, поскольку при наличии mob-участка в векторах, необходимых для конъюгативного переноса, возможна случайная мобилизация плазмиды и ее переход из клеток маркированных штаммов в другие почвенные бактерии.

У растений L. vernus, L. palustris и L. gmelinii обнаружено несколько изоформ лектинов, что может быть причиной выявленной в работе пластичности при выборе микросимбионтов данными видами растений.

Показана специфичность агглютинации лектинами из семян гороха посевного (Pisum sativum) (PSL) ризобий R. leguminosarum bv. viciae, и лектинами из семян козлятника восточного (Galega orientalis) (GOL) -R. galegae.

Продемонстрировано, что используя гены лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, можно создавать искусственные ассоциации клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями. На трансгенных по гену лектина PSL гороха растениях табака показана избирательность колонизации их ризосферы бактериями R. leguminosarum bv. viciae в условиях конкуренции с естественной микрофлорой почвы.

Практическая значимость работы. Собрана и генетически охарактеризована коллекция штаммов клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими бобовыми растениями Южного Урала. Сведения о генетическом разнообразии и филогении клубеньковых бактерий, полученные в ходе исследований, могут быть использованы как для селекции высокоэффективных и приспособленных к почвенно-климатическим условиям Южного Урала штаммов клубеньковых бактерий, так и для создания штаммов ризобий с полезными для сельского хозяйства признаками. В связи с тесным взаимодействием бобовых растений со своими микросимбионтами, зачастую определяющих их экологическую нишу и нередко ареал распространения, новые знания о молекулярно-генетических особенностях и биоразнообразии клубеньковых бактерий таких краснокнижных видов бобовых как L. litvinovii, A. cornu tus, A. helmii, H. grandiflorum, H. razoumowianum, O. hippolyti сделают возможным успешное интродуцирование этих растений из неблагоприятных мест в другие районы, и тем самым обеспечат их сохранение.

Серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, созданных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий, может быть использована для научных экспериментов в области изучения бобово-ризобиальных симбиозов.

Разработанный экспериментальный подход к конструированию «искусственной ризосферы» несимбиотрофных растений, избирательно колонизируемой клубеньковыми бактериями (выполняющими полезные для растений трофические, ростостимулирующие и/или защитные функции), путем введения в их геном в качестве трансгена гена лектина бобового растения, с которым данные ризобии вступают в симбиоз, может быть использован для создания стабильных и эффективных ассоциаций хозяйственно-полезных растений с ростостимулирующими азотфиксирующими микроорганизмами, которые могут найти самое широкое коммерческое применение в сельскохозяйственном производстве.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Клубеньковые бактерии дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала представлены всеми основными родами ризобий: ЯЫ2оЬшт, МезогШгоЬшт, Еж1/ег (БтогЫгоЬшт), Вгас^угЫгоЫит.

2. Основными симбионтами дикорастущих видов бобовых растений подтрибы Аз1;га§а1шае трибы ва^еае и трибы НеёуБагеае в почвенно-климатических условиях Южного Урала являются бактерии рода МеБогШгоЫит.

3. Для растений трибы Оегш1еае характерно преобладание в клубеньках бактерий рода ВгснЗугШгоЫит.

4. Для клубеньковых бактерий дикорастущих видов растений трибы Ую1еае, относящихся к виду КЫгоЫит /е^иттоБагит, характерна высокая степень гетерогенности, обусловленная различиями в их плазмидном составе.

5. Используя гены лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, можно создавать искусственные ассоциации клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье (№ 10-04-97018а) и грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ России (НШ-1003.2006.4 и НШ-649.2008.4), ГК N02.740.11.0290 ФЦП

Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092020гг.»

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006); Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006); III Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); V Всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2020); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2020); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)» (Москва, 2020); VI Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2020); Международной конференции «Микробиология в решении современных проблем сельскохозяйственной микробиологии» (Санкт-Петербург, 2020).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 35 печатных работах, в том числе, 17 статей опубликованы в журналах из Перечня ВАК, из них 14 из международной базы цитирования, в 1-й монографии, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах, содержит 36 рисунков и 6 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 667 работ.

Заключение Диссертация по теме «Молекулярная биология», Баймиев, Андрей Ханифович

1. Собрана и генетически охарактеризована коллекция клубеньковых бактерий 36 видов дикорастущих бобовых растений Южного Урала, относящихся к 12 родам, состоящая из 1217 штаммов.

2. Обнаружена высокая полиморфность ДНК бактерий, вступающих в симбиоз с бобовыми растениями трибы Vicieae. Коэффициент гетерогенности Шеннона у исследованных штаммов составил от 0,32 для ризобий чины Литвинова до 0,82 для ризобий чины клубненосной. Показано, что их гетерогенность вызвана различиями в плазмидном составе, что говорит о высокой рекомбинационной активности данных бактерий.

3. У четырех видов рода Lathyrus в клубеньках обнаружены микросимбионты, которые считались для них несвойственными (L. vemus и L. sylvestris — R. tropici, L. palustris — Agrobacterium sp., L. gmelinii -Phyllobacterium sp.).

4. Выявлено, что симбиотические гены ( Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Баймиев, Андрей Ханифович, Уфа

1. Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Баймиев Ан.Х., Чемерис A.B. Сайт-направленный мутагенез углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений с использованием инвертированной ПЦР // Мол. биология. 2007. -Т. 41,-С. 940-942.

2. Баулина О.И., Агафодорова М.Н., Корженевская Т.Г., Гусев М.В., Бутенко Р.Г. Цианобактерии в искусственно созданной ассоциации с каллусной тканью табака // Микробиология. 1984. — Т. 53, — № 6. — С. 9971002.

3. Белимов A.A., Сафронова В.И. АЦК деаминаза и растительно-микробные взаимодействия // Сельхоз. биология. 2020. — №3. — С. 23-28.

4. Вишнякова М.А., Бурляева М.О., Алпатьева Н.В., Чесноков Ю.В. RAPD анализ видового полиморфизма рода чина Lathyrus L. семейства Fabaceae Lindl. // Вестник ВОГиС. 2008. — Т. 12, — № 4. — С. 595-607.

5. Глаголева О.Б., Ковальская Н.Ю., Киреев И.И., Лобакова Е.С., Умаров М.М. Паранодуляция рапса при инокуляции азотфиксирующими ризосферными бактериями // Микробиология. 1997. — № 66. — С. 545-552.

6. Горелова O.A., Лобакова Е.С., Корженевская Т.Г. Инфекционная активность изолированных из природных симбиозов цианобактерий вотношении нееимбиотрофных растений // Вестн. Московского ун-та. Сер. 16, Биология. 2004. — № 3. — С. 39-44.

7. Долгих Е. А., Леппянен И. В., Жуков В. А., Цыганов В. Е., Тихонович И. А. Экспрессия рекомбинантных белков-рецепторов SymlO и Sym37 Pisum sativum, вовлеченных в связывание липохитоолигосахаридов nod-факторов // Экол. генет. .-2020.-Т. 8, № i.c. 3-11.

8. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. / Генная инженерия растений (лабораторное руководство). М.: Мир, 1991. 173 с.

9. Жуков В.А., Рычагова Т.С., Штарк О.Ю., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Генетический контроль специфичности взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями // Экол. генет. 2008. — Т. 7, — № 4. — С. 12-19

10. Карпунина Л.В. Значение углевод-белкового узнавания и роль лектинов при формировании различного рода азотфиксирующих систем // Успехи соврем, биологии. 2002. — Т. 122, — № 6. — С. 548-556.

11. Кауричева С.И. Практикум по почвоведению / М.: «Колос», 1973. 279 с.

12. Кацы Е.И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий и растений / М.: Наука, 2007.- 86 с.

13. Ковальская Н.Ю., Лобакова Е.С., Умаров М.М. Формирование искусственного азотфиксирующего симбиоза у растений рапса

14. Кретович В.А. Биохимия усвоения азота воздуха растениями / М.: Наука, 1994.- 168 с.

15. Лахтин В.М. Молекулярная организация лектинов // Мол. биология. -1994. Т. 28, — № 2. — С. 245-273.

16. Максимов И. В., Абизгильдина Р. Р., Пусенкова Л. И. Стимулирующие рост растений микроорганизмы как альтернатива химическим средствам защиты от патогенов (обзор) // Прикл биохим микробиол. 2020, — Т. 47, — № 4,-С. 373-385

17. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс / М.: Наука, 1973.- 288 с.

18. Новикова Н.И., Сафронова В.И., Павлова Е.А. // Сельскохозяйств. биология. 1992. — Т.5. — С. 105-109.

19. Овцына А.О., Тихонович И.А. Структура, функции и возможность практического применения сигнальных молекул, инициирующих развитие бобово-ризобиального симбиоза // Экол. генет. 2004. — Т. 2, — № 3. — С. 1424.

20. Онищук О.П., Симаров Б.В. Генетическая изменчивость нодуляционной конкурентоспособности у клубеньковых бактерий и ее использование в селекции. // Генетика. 1995. — Т. 31, — № 3, — С. 293 — 303

21. Парийская А.Н., Клевенская И.Л. Распространение в природе и возможные пути эволюции азотфиксирующего симбиоза // Успехи микробиол. 1979. — Т. 14. — С. 124-147.

22. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений / М.: Наука, 1985. 289 с.

23. Проворов H.A. Взаимосвязь между таксономией бобовых и специфичностью их взаимодействия с клубеньковыми бактериями // Ботан. журн. 1992. — Т. 77, — № 8. — С. 21-32.

24. Проворов H.A., Воробьев H.H. Эволюционная генетика клубеньковых бактерий: молекулярные и популяционные аспекты // Генетика. 2000. — Т. 36, -№ 12.-С. 1573-1587

25. Проворов H.A. Генетико-эволюционные основы учения о симбиозе // Журн. Общей биологии. 2001. — Т. 62,-№ 6.- С. 472-495.

26. Проворов H.A., Тихонович И.А. Экологогенетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами // С.-х. биология. 2003. — № 3. — С. 11-25.

27. Проворов Н. А. Растительно-микробные симбиозы как эволюционный континуум // Журн. Общей биологии. 2009. — Т. 70, — № 1, — С. 10-34

28. Проворов H.A., Воробьев Н.И. Роль горизонтального переноса генов в эволюции клубеньковых бактерий, направляемой растением-хозяином // Успехи современной биологии. 2020. — Т. 130, — № 4. — С. 336-345

29. Радчук В.В., Блюм Я.Б. Успехи и проблемы генетической трансформации растений семейства крестоцветных // Цитология и генетика. -2005. -№ 3. С. 13-29.

30. Садовникова Ю.Н., Беспалова JI.A., Антонюк Л.П. Агглютинин зародышей пшеницы является фактором роста для бактерии Azospirillum brasilense II Докл. Акад. наук. 2003. — Т. 389, № 4. — С. 544-546.

31. Серебряков И.Г. Экологическая морфология растений. 1962. Жизненные формы покрытосеменных и хвойных. М.: Высш. шк., 387 с.

32. Сидорова К.К., Шумный В.К., Власова Е.Ю., Гляненко М.Н., Мищенко Т.М., Майстренко Г.Г. Симбиогенетика и селекция макросимбионта на повышение азотфиксации на примере гороха (Pisum sativum L.) // Вестник ВОГиС. 2020, — Т. 14, — № 2. — С. 357-374

33. Симаров Б.В., Аронштам A.A., Новикова Н.И. и др. Генетические основы селекции клубеньковых бактерий / Л.: Агропромиздат, 1990. 192 с.

34. Тильба В.А., Бегун С.А., Якименко М.В. Использование штаммов ризобий сои для стимулирования роста и оздоровления сельскохозяйственных культур (опыты с зернобобовыми культурами и томатами) // Вестн. РАСХН. 2004. — № 5. — С. 28-30.

35. Тихонович И.А., Проворов H.A. Пути использования адаптивного потенциала систем «растение-микроорганизм» для конструирования высокопродуктивных агрофитоценозов // С.-х. биология. 1993. — № 5. — С. 36-46.

36. Тихонович И.А., Проворов H.A. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции / СПб.: Наука, 1998. 194 с.

37. Тихонович И.А., Проворов H.A. Принципы селекции растений на взаимодействие с симбиотическими микроорганизмами // Вестник ВОГиС. -2005. Т. 9, — № 3. — С. 295-305.

38. Тихонович И.А, Проворов H.A., 2009. Симбиозы растений и микроорганизмов / С.-Пб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 210с.

39. Умаров М.М., Бурлуцкая Т.Р., Давидович О.Г., Матвеева Н.Г. Влияние инокуляции бактериями рода Pseudomonas на процессы азотного цикла в ризосфере небобовых растений // Микробиология. 1994. — Т. 63, — № 2. — С. 326-333.

40. Умаров М.М. Современное состояние и перспективы исследований микробной азотфиксации / Перспективы развития почвенной биологии. М.: МАКС Пресс, 2001. С. 47-56.

41. Шакирова Ф.М., Безрукова М.В. Современные представления о предпологаемых функциях лектинов растений // Журн. общ. биологии. -2007. Т. 68, — № 2. — С. 109-125.

42. Шестаков С.В. Как происходит и чем регулируется горизонтальный перенос у бактерий // Экологич. генетика. 2007. — Т. 5, — № 2. — С. 12-24.

43. Abd-Alla М.Н. Use of organic phosphorous by Rhizobium leguminosarum bv. viciae phosphatases. // Biol. Fertil. Soils. 1994. — V. 8. — P. 216-218.

44. Achouak W., Christen R., Barakat M., Martel M.H., Heulin T. Burkholderia caribensis sp. nov., an exopolysaccharide-producing bacterium isolated from vertisol microaggregates in Martinique // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. — V. 49. -P. 787-94.

45. Aguilar O.M., Grasso D.H., Riccillo P.M., Lopez M.V., Szafer E. Rapid identification of bean Rhizobium isolates by a niffl gene-pcr assay // Soil Biol Biochem. 1998.-V. 30. -P.1655-1661

46. Aguilar O.M., Riva O., Peltzer E. Analysis of Rhizobium etli and of its symbiosis with wild Phaseolus vulgaris supports coevolution in centers of host diversification // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. — V.101. — P. 13548-13553

47. Akasaka Y., Mii M., Daimon H. Morphological alterations and root nodule formation in Agrobacterium rhizogenes-mediated transgenic hairy roots of peanut (Arachis hypogaea L.) // Ann. Bot. 1998. — V. 81. — P. 355-362.

48. Alexandre A., Laranjo M., Young J.P., Oliveira S. Dnaj is a useful phylogenetic marker for alphaproteobacteria // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. -V. 58.-P. 2839-2849

49. Alikhani H.A., Saleh-Rastin N., Antoun H. Phosphate solubilization activity of rhizobia native to Iranian soils. // Plant Soil. 2006. — V. 287. — P. 35-41.

50. Algawadi A.R., Gaur A.C. Inoculation of Azospirillum brasilense and phosphate-solubilizing bacteria on yield of sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) in dry land. // Trop. Agric. 1992. — V. 69. — P. 347-350.

51. Amara M.A.T., Dahdoh M.S.A. Effect of inoculation with plantgrowth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield and uptake of nutrients by wheat grown on sandy soil. // Egyptian J. Soil Sci. 1997. — V. 37. — P. 467^84.

52. Amarger N., Macheret V., Laguerre G. Rhizobium gallicum sp. nov. and Rhizobium giardinii sp. nov., from Phaseolus vulgaris nodules // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. — V. 47. — P. 996-1006.

53. Aminov R. I. Horizontal gene exchange in environmental microbiota // Front Microbiol. 2020. — V. 2. — doi: 10.3389.

54. Andam C.P., Parker M.A. Novel alphaproteobacterial root nodule symbiont associated with Lupinus texensis // Appl. Environ. Microbiol. 2007a. — V. 73, -N. 17.-P. 5687-5691

55. Andam C. P., Mondo S. J., Parker M. A. Monophyly of nodA and nifH Genes across Texan and Costa Rican Populations of Cupriavidus Nodule Symbionts // Appl. Environ. Microbiol. 2007b. — V. 73, — N.14. — P. 4686-4690.

56. Andrade D.S., Murphy P.J., Giller K.J. The diversity of Phaseolus-nodulating rhizobial populations is altered by liming of acid soils planted with Phaseolus vulgaris L. in Brazil. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. — V. 68. — P. 4025^034

57. Antoine R., Locht C. Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from gram-positive organisms // Mol. Microbiol. 1992. -V. 6.-P. 1785-1799.

58. Antoun H., Beauchamp C.J., Goussard N., Chabot R., Lalande R. Potential of Rhizobium and Bradyrhizobium species as plant growth promoting rhizobacteria on non-legumes: Effect on radishes (Raphanus sativus L.). // Plant Soil. : 1998. -V. 204. P. 57-68.

59. Arora N.K., Kang S.C., Maheshwari D.K. Isolation of siderophoreproducing strains of Rhizobium meliloti and their biocontrol potential against Macrophomina phaseolina that causes charcoal rot of groundnut. // Curr. Sci. 2001. — V. 81. — P. 673-677.

60. Arshad M., Shaharoona B., Mahmood T. Inoculation with Pseudomonas spp. containing ACC deaminase partially eliminates the effects of drought stress on growth, yield, and ripening of pea (Pisum sativum L.). // Pedosphere. 2008. — V. 18.-P. 611-620.

61. Atzorn R., Crozier A., Wheeler C.T., Sandberg G. Production of gibberellins and indol-3-acetic acid by Rhizobium phaseoli in relation to nodulation of Phaseolus vulgaris roots. // Planta. 1988. — V. 175. — P. 532-538.

62. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. / Current protocols in molecular biology. 1987. John Wiley&Sons, NY

63. Baldani J.I., Weaver R.W., Hynes M.F., Eardly B.D. Utilization of carbon substrates, electrophoretic enzyme patterns, and symbiotic performance of plasmid-cured clover rhizobia // Appl. Environ. Microbiol. 1992. — V. 58. — N. 7. -P. 2308-2314

64. Baier R., Schiene K., Kohring B., Flaschen E., Niehaus K. Alfalfa and tobacco cells react differentially to chitin oligosaccharides and Sinorhizobium meliloti nodulation factors. // Planta. 1999. — V. 210. — P. 157-164.

65. Bailly X., Olivieri I., Brunei B., Cleyet-Marel J.C., Bena G. Horizontal gene transfer and homologous recombination drive the evolution of the nitrogen-fixing symbionts of Medicago species. // J. Bacteriol. 2007. — V. 189. — P. 5223^5236

66. Banerjee M., Yesmin L. Sulfur-oxidizing plant growth promoting rhizobacteria for enhanced canola performance / US Patent. 2002. N. 07491535.

67. Bardin S., Dan S., Osteras M., Finan T.M. A phosphate transport system is required for symbiotic nitrogen fixation by Rhizobium meliloti // J Bacteriol. -1996.-V. 178. -N. 15. P. 4540-4547.

68. Barnett M.J., Fisher R.F., Jones T., Komp C., Abola A.P. et al. Nucleotide sequence and predicted functions of the entire Sinorhizobium meliloti pSymA megaplasmid. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. — V. 98. — P. 9883-9888

69. Barnett M.J., Fisher R.F. Global gene expression in the rhizobial-legume symbiosis. // Symbiosis. 2006. — V. 42. — P. 1-24

70. Barrett C.F., Parker M.A. Prevalence of Burkholderia sp. nodule symbionts on four mimosoid legumes from Barro Colorado Island, Panama. // Syst Appl Microbiol. 2005. — V. 28. — P. 57-65

71. Bashan Y. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture // Biotech. Adv. 1998. — V. 16, N 4. — P. 729-770.

72. Batut J., Andersson S.G., O’Callaghan D. The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria. // Nat Rev Microbiol. 2004. — V. 2. — P. 933-945

73. Becker A., Fraysse N., Sharypova L. Recent advances in studies on structure and symbiosisrelated function of rhizobial K-antigens and lipopolysaccharides. // Mol Plant Microbe Interact. 2005. — V. 18. — P. 899-905

74. Benata H., Mohammed O., Noureddine B., Abdelbasset B., Abdelmoumen H., Muresu R., Squartini A., El Idrissi M.M. Diversity of bacteria that nodulate Prosopis juliflora in the eastern area of Morocco. // Syst Appl Microbiol. 2008. -V. 31.-P. 378-386

75. Benhizia Y., Benhizia H., Benguedouar A., Muresu R., Giacomini A., Squartini A. Gamma proteobacteria can nodulate legumes of the genus Hedysarum. // Syst Appl Microbiol. 2004. — V. 27. — P. 462^68

76. Bentley S.D., Parkhill J. Comparative genomic structure of prokaryotes. // Annu Rev Genet. 2004. — V. 38. — P. 771-792

77. Belimov A.A., Kojemiakov P.A., Chuvarliyeva C.V. Interaction between barley andmixed cultures of nitrogen fixing and phosphate-solubilizing bacteria. // Plant Soil. // 1995. — V. 173. — P. 29-37.

78. Berg R.H., Liu L., Dawson J.O., Savka A.M., Farrand S.K. Induction of pseudoactinorhizae by the plant pathogen Agrobacterium rhizogenes // Plant Physiol. 1992. — V.98. — P. 777-779.

79. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. — V. 7. — PJ513-1523^

80. Biswas J.C., Ladha J.K., Dazzo F.B., Yanni Y.G., Rolfe B.G. Rhizobial inoculation influences seedling vigor and yield of rice //Agron. J. 2000. — V. 92. — P. 880-886.

81. Bhatia R., Dogra R.C., Sharma P.K. Construction of green fluorescent protein (GFP)-marked strains of Bradyrhizobium for ecological studies. // J. Appl. Microbiol. 2002. — V. 93. — P. 835-839.

82. Bohlool B.B., Schmidt E.L. Lectins: a possible basis for specificity in the Rhizobium-legume symbiosis // Science. 1974. — V. 185. — P. 269-275.

83. Boisson-Dernier A., Chabaud M., Garcia F., Becard G., Rosenberg C. and Barker D.G. Hairy roots of Medicago truncatula as tools for studying nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbioses // Mol. Plant-Microbe Interact. 2001. — V. 14.-P. 693-700.

84. Bokman S. H., Ward W. W. Renaturation of Aequorea Green-Fluorescent Protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. — V. 101. — P. 1372—1380.

85. Boussau B., Karlberg E.O., Frank A.C., Legault B.A., Andersson S.G. Computational inference of scenarios for alpha-proteobacterial genome evolution // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. — V. 101. — P. 9722-9727.

86. Breil B.T., Ludden P.W., Triplett E. W. DNA sequence and mutational analysis of genes involved in the production and resistance of the antibiotic peptide trifolitoxin. // J. Bacteriol. 1993. — V. 175. — P. 3693-3702.

87. Brelles-Marino G., Costa G.A., Boiardi J.L. Enhancement of infection thread formation by Rhizobium etli incubated with bean seed lectin // Microbiol. Res. -1996.-V. 151.-P. 243-246.

88. Brewin N.J., Dejong T.M., Phillips D.A., B. Johnston A.W. Co-transfer of determinants for hydrogenase activity and nodulation ability in Rhizobium leguminosarum // Nature. 1980. — V. 288. — P. 77-79.

89. Brewin N.J. Tissue and cell invasion by Rhizobium’. the structure and development of infection threads and symbiosomes / The Rhizobiaceae. (Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J., Eds.). Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, -1998. P. 417 -429.

90. Brewin N.J. Plant cell wall remodeling in the Rhizobium-legume symbiosis // Crit Rev Plant Sci. 2004. — V. 23. — P. 293-316.

91. Brockwell J., Bottomley P.J., Thies J.E. Manipulation of rhizobia microflora for improving legume productivity and soil fertility: a critical assessment // Plant Soil. 1995. — V. 174. — P. 143-180.

92. Broekaert W.F., van Parijs J., Leyns F., Joos H., Peumans W.J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with anti-fungal properties // Science. 1989. — V. 245. — P. 1100-1102.

93. Brom S., de los Santos A.G., de Lourdes Girard M., Davilla G., Palacios R., Romero D. Highfrequency rearrangements in Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli plasmids // J. Bacteriol. 1991. — V. 173. — P. 1344-1346.

94. Bromfield E.S.P., Lewis D.M., Barran L.R. Cryptic plasmid and rifampin resistance in Rhizobium meliloti influencing nodulation competitiveness // J. Bacteriol. 1985.-V. 164.-P. 410-413

95. Broothaerts W., Mitchell H.J., Weir B., Kaines S., Smith L.M., Yang W., Mayer J.E., Roa-Rodnguez C., Jefferson R.A. Gene transfer to plants by diverse species of bacteria // Nature. 2005. — V. 433. — P. 629-633

96. Broughton W.J., Perret X. Genealogy of legume-Rhizobium symbioses // Curr Opin Plant Biol. 1999. — V. 2. — P. 305-311

97. Broughton W.J., Jabbouri S., Perret X. Keys to symbiotic harmony // J Bacteriol. 2000. — V. 182.-P. 5641-5652

98. Brown J. R. Ancient horizontal gene transfer // Nature Rev. Genet. 2003. — V. 4.-P. 121-132.

99. Buchanan R.E. What names should be used for the organisms producing nodules on the roots of leguminous plants? // Proc Iowa Acad Sci. 1926. — V. 33. -P. 81-90

100. Burd G.I., Dixon D.G., Glick B.R. Plant growth-promoting bacteria that decrease heavy metal toxicity in plants. // Can. J. Microbiol. 2000. — V. 46. — P. 237-245.

101. Campbell G.R.O., Reuhs B.L., Walker G.C. Chronic intracellular infection of alfalfa nodules by Sinorhizobium meliloti requires correct lipopolysaccharide core // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. — V. 99. — P. 3938-3943

102. Capoen W., Goormachtig S., de Rycke R., Schroeyers K., Holsters M. SrSymRK, a plant receptor essential for symbiosome formation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005. — V. 102. — P.10369-10374.

103. Casida L.E. Ensifer adhaerens gen. nov., sp. nov.: a bacterial predator of bacteria in soil // Int. J. Syst. Bacteriol. 1982. — V. 32. — P. 339-345

104. Chabot R., Antoun H., Cescas M. P. Stimulation de la croissance du mais et de la laitue romaine par des microorganismes dissolvant le phosphore inorganique. // Can. J. Microbiol. 1993. — V. 39. — P. 941-947.

105. Chabot R. H., Antoun H., Kloepper J., Beauchamp C. Root colonization of maize and lettuce by bioluminescent Rhizobium leguminosarum biovar phaseolus II Appl. Environ. Microbiol. 1996. — V. 62. — P. 2767-2772.

106. Chahboune R., Carro L., Peix A., Barrijal S., Velazquez E., Bedmar E.J. Bradyrhizobium cytisi sp. nov., isolated from effective nodules of Cytisus villosus // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020. — V. 61, — N. 12. — P. 2922-2927

107. Chang Y.L., Wang J.Y., Wang E.T., Liu H.C., Sui X.H., Chen W.X. Bradyrhizobium lablabi sp. nov., isolated from effective nodules of Lablab purpureus and Arachis hypogaea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020. — V. 61, -N. 10. -P. 2496-502.

108. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W., Prasher D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. 1994. — V. 263. -V. 802—805.

109. Chao W.L. Antagonistic activity of Rhizobium spp. against beneficial and plant pathogenic fungi // Lett. Appl. Microbiol. 1990. — V. 10, — N. 5. — P. 213215.

110. Chen W.X., Yan G.H., Li J.L. Numerical taxonomy study of fast-growing soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be assigned to Sinorhizobium gen. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1988. — V. 38. — P. 392-397

111. Chen W.X., Li G.S., Qi Y.L., Wang EI, Yuan H.L., Li J.L. Mizobium huakuii sp. nov., isolated from the root nodules of Astragalus sinicus // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. — V. 41. — P. 275-280

112. Chen W., Xie Y., Chen T. Studies on para-nodulation of wheat and nitrogen fixation //10 Int. Congr. on Nitrogen fixation: Abst. St.-Petersburg, 1995. P. 358.

113. Chen W.X., Tan Z.Y., Gao J.L., Li Y., Wang E.T. Rhizobium hainanense sp. nov., isolated from tropical legumes // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. — V. 47. — N. 3. P. 870-873.

114. Chen W.M., James E.K., Prescott A.R., Kierans M., Sprent J.I. Nodulation of Mimosa spp. by the beta-proteobacterium Ralstonia taiwanensis. // Mol. Plant Microbe Interact. 2003a. — V. 16. — P. 1051-1061

115. Chen W.M., Moulin L., Bontemps C., Vandamme P., Bena G., Boivin-Masson C. Legume symbiotic nitrogen fixation by beta-proteobacteria is widespread in nature // J Bacteriol. 2003b. — V. 185. — P. 7266-7272

116. Chen W.M., James E.K., Chou J.H., Sheu S.Y., Yang S.Z., Sprent J.I. Beta-rhizobia from Mimosa pigra, a newly discovered invasive plant in Taiwan // New Phytol. 2005. — V. 168. — P. 661-675

117. Chen W.M., Zhu W.F., Bontemps C., Young J.P.W., Wei G.H. Mesorhizobium alhagi sp. nov., isolated from wild Alhagi sparsifolia in northwestern China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020. — V. 60. — P. 958-962

118. Chen W.M., Zhu W.F., Bontemps C., Young J.P., Wei G.H. Mesorhizobium camelthorni sp. nov., isolated from Alhagi sparsifolia // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2020. -V. 61. P. 574-9.

119. Chrispeels M.J., Raikhel N.V. Lectins, lectin genes and their role in plant defense. // Plant Cell. 1991. — V. 3. — P. 1-9

120. Christey M. C. Transgenic crop plants using Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation // Hairy roots: culture and applications / Harwood Acad. Pub., Amsterdam, 1997. P. 99-110.

121. Clewell D.B., Helinski D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular DNA form // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. — V. 62, N4,- P.1159-1166.

122. Cocking E.C., Davey M.R Nitrogen from the air for non-legume crops // Chem. Industry. 1991. — P. 831-835.

123. Cohen S., Chang A., Hsu L. Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria Genetic Transformation of E. coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1972. — V. 69. — P. 2110-2114.

124. Collier R., Fuchs B., Walter N., Lutke W.K., Taylor C.G. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology // Plant J. 2005. — V. 43. -P. 449-457.

125. Conn H.J. Taxonomic relationships of certain non-sporeforming rods in soil // J. Bacteriol. 1938. — V. 36. — P. 320-321

126. Cren M., Kondorosi A., Kondorosi E. NolR controls expression of the Rhizobium meliloti nodulation genes involved in the core Nod factor synthesis // Mol. Microbiol. 1995. — V. 15. — P. 733-747

127. Cubitt A. B., Heim R., Adams S. R., Boyd A. E., Gross L. A., Tsien R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins // Trends Biochem. Sci. 1995. — V.20. — P. 448—455.

128. Dakora F.D. Defining new roles for plant and rhizobial molecules in sole and mixed plant cultures involving symbiotic legumes. // New Phytol. 2003. — V. 58. — P. 39-49.

129. Dalton D.A., Boniface C., Turner Z., Lindahl A., Kim H.J., Jelinek L., Govindarajulu M., Finger R.E., Taylor C.G. Physiological Roles of Glutathione S-Transferases in Soybean Root Nodules // Plant Physiology. 2009. — V. 150. — P. 521-530

130. Day B.R., McAlvin C.B., Loh J.T., Denny R.L., Wood T.C., Young N.D., Stacey G. Differential expression of two soybean apyrases, one of which is an early nodulin. Mol. Plant-Microbe Interact. 2000. — V. 13. — P. 1053-1070.

131. Dazzo F.B., Hubbell D.H. Cross-reactive antigens and lectins as determinants of symbiotic specificity in the Rhizobium-clover association // Appl. Environ. Microbiol. 1975. — V. 48. — P. 1140-1150.

132. Dazzo F.B., Truchet G.L, Sherwood J.E. Alteration of the trifolin A-binding capsule of Rhizobium trifolii -0403 by enzymes released from clover roots // Appl. Environ. Microbiol. 1982. — V. 44. — P. 478-490.

133. D’Haeze W., Holsters M. Nod factor structures, responses and perception during initiation of nodule development // Glycobiol. -2002. -V. 12. -P. 79-105 De Bary A. Die Erschaenung der symbiose / Strassburg: Verlag Von Karl J. Trubner. 1879. 30p.

134. Debelle F., Rosenberg C., Vasse J., Maillet F., Martinez E., Denarie J., Truchet G. Assignment of symbiotic developmental phenotypes to common and specific nodulation (nod) genetic loci of Rhizobium meliloti // J Bacteriol. 1986. -V. 168.-P. 1075-1086

135. De Hoff P. L., Brill L. M., Hirsch A. M. Plant lectins: the ties that bind in root symbiosis and plant defense // Mol Genet Genomics. 2009. — V. 282^- P.1-15

136. Denarie J., Cullimore J. Lipo-oligosaccharide nodulation factors: New class of signaling molecules mediating recognition and morphogenesis // Cell. 1993. — V. 74.-P. 951-954

137. Denarie J., Debbelle F., Prome J.C. Rhizobium lipo-chitin-oligosaccharide nodulation factors: signaling molecules mediating recognition and morphogenesis // Ann. Rev. Biochem. 1996. — V. 65. — P. 503-535.

138. Depret G., Laguerre G. Plant phenology and genetic variability in root and nodule development strongly influence genetic structuring of Rhizobium leguminosarum biovar viciae populations nodulating pea // New Phytol. 2008. -V. 179.-P. 224-235

139. Deshwal V.K., Dubey R.C., Maheshwari D. K. Isolation of plant growth promoting strains of Bradyrhizobium (Arachis) sp. with biocontrol potential against Macrophomina phaseolina causing charcol rot of peanut. // Curr. Sci. -2003.-V. 84.-P. 443—444.

140. Devine T.E., Kuykendall L.D. Host genetic control of symbiosis in soybean 0Glycine max L.) // Plant and Soil. 1996. — V. 186. — P. 173-187.

141. Diaz C.L., Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., Lugtenberg B.J.J., Kijne J.W. Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium-legume symbiosis //Nature. 1989. — V. 338.-P. 579-581.

142. Diaz C.L., Spaink H.P., Kijne J.W. Heterologous rhizobal lipochitin oligosaccharides and chitin oligomers induce cortical cell divisions in red clover root, transformed with the pea lectin gene // Mol. Plant Microbe Interact. 2000. -V. 13.-P. 268-276.

143. Dietrich C., Maiss E. Fluorescent labelling reveals spatial separation of potyvirus populations in mixed infected Nicotiana benthamiana plants // J. Gen. Virol. 2003. — V. 84. — P. 2871—2876.

144. Diouf D., Gherbi H., Prin Y., Franche C., Duhoux E., Bogusz D. Hairy root nodulation of Casuarina glauca: a system for the study of symbiotic gene expression in an actinorhizal tree // Mol. Plant Microbe Interact. 1995. — V. 8. -P. 532-537.

145. Diouf D., Diop T.A., Ndoye I. Actinorhizal, mycorhizal and rhizobial symbioses: how much do we know? // Afr. J. Biotechnol. 2003. — V. 2, N 1. — P. 1-7.

146. Dombrecht B., Tesfay M.Z., Verreth C., Heusdens C., Napoles M.C., Vanderleyden J., Michiels J. The Rhizobium etli gene iscN is highly expressed in bacteroids and required for nitrogen fixation. // Mol Gen Genomics. 2002. — V. 267.-P. 820-828

147. Doolittle W. F. Lateral genomics //Trends Cell Biol. 1999. — N 9. — P. M51. M9.

148. Downie J.A. Signalling strategies for nodulation of legumes by rhizobia // Trends Microbiol. 1994. — V. 2. — P. 318-324

149. Doyle J.J. Phylogenetic perspectives of nodulation: evolving views of plants and symbiotic bacteria // Trends Plant Sci. 1998. — V. 3. — P. 473-478

150. Duckworth D.H. Who discovered bacteriophage? // Bacteriol. Rev. 1976. -V. 40. — P. 793-802.

151. Duodu S., Brophy C., Connolly J., Svenning M.M. Competitiveness of native Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strain for nodule occupancy is manifested during infection // Plant Soil. 2009. — V. 318. — P. 117-126.

152. Dyachok J.V., Tobin A.E., Price N.P.J., von Arnold S. Rhizobial Nod factors stimulate somatic embryo development in Picea abies // Plant Cell Rep. 2000. -V. 19.-P. 290-297

153. Eckhardt M.M., Baldwin I.R., Fred E.B. Studies on the root-nodule bacteria of Lupinus//J. Bacteriol. 1931. — V. 21. — P. 273-285.

154. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmiddesoxyribonucleic acid in bacteria // Plasmid. 1978. — V.l. — P.584-588.

155. Edelman G.M., Cunningham B.A., Reede G.N., Becher J.W., Waxdal M.J., Wang J.L. The covalent and three-dimensional structure of concanavalin A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. — V. 69. — P. 2580-2584

156. Egan E.S., Fogel M.A., Waldor M.K. Divided genomes: negotiating the cell cycle in prokaryotes with multiple chromosomes // Mol Microbiol. 2005. — V. 56. -P. 1129-1138.

157. Elliott G.N., Chen W.M., Bontemps C., Chou J.H., Young J.P., Sprent J.L, James E.K. Nodulation of Cyclopia spp. (Leguminosae, Papilionoideae) by Burkholderia tuberum // Ann. Bot. (Lond). 2007a. — V. 100. — P. .1403-1411,

158. Elliott G.N., Chen W.M., Chou J.H. et al. Burkholderia phymatum is a highly effective nitrogen-fixing symbiont of Mimosa spp. and fixes nitrogen ex planta // New Phytol. 2007b. — V. 173.-P. 168-180.

159. Elmerich C., Dezamaroczy M., Arsene F. et al. Regulation of nif geneexpression and nitrogen-metabolism in Azospirillum II Soil Biol. Biochem. 1997. -V. 29, N5-6.-P. 847-852.

160. Elzer P.H., Kovach M.E., Phillips R.W., Robertson G.T., Peterson K.M., Roop R.M. In vivo and in vitro stability of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS in six Brucella species // Plasmid. 1995. — V. 33. — P. 51-57.

161. Esashi Y. Ethylene and seed germination / In: The Plant Hormone Ethylene. (Matoo A.K., Suttle J.C., Eds.). CRC Press, Boca Raton, FL. USA. 1991. -P. 133-157.

162. Estrella M. J., Munoz S., Soto M. J. Ruiz O., Sanjuan J. Genetic diversity and host range of rhizobia nodulating Lotus tenuis in typical soils of the Salado River Basin (Argentina) // Appl. environ, microbial. 2009. — V.75, — N.4. — P. 1088-1098

163. Etzler M.E., Kalsi G., Ewing N.N., Roberts N.J., Day R.B., Murphy J.B. A nod factor binding lectin with apyrase activity from legume roots // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. — V.96.-P. 5856-5861.

164. Fedorova M , van de Mortel J., Matsumoto P.A., Cho J., Town C.D., VandenBosch K.A., Gantt J.S., Vance C.P. Genome-wide identification of nodule-specific transcripts in the model legume Medicago truncatula // Plant Physiol. -2002.-V. 130.-P. 519-537.

165. Feng J., Li Q., Hu H.L., Chen X.C., Hong G.F. Inactivation of the nod box distal half-site allows tetrameric NodD to activate nodA transcription in an inducer-independent manner // Nucleic Acids Res. 2003. — V. 31. — P. 31433156.

166. Fernandez L.A., Zalba P., Gomez M.A., Sagardoy M.A. Phosphate-solubilization activity of bacterial strains in soil and their effect on soybean growth under greenhouse conditions. // Biol. Fertil. Soils. 2007. — V. 43. — P. 805-809.

167. Finan T.M. Evolving insights: symbiosis islands and horizontal gene transfer // J. Bacteriol. V. 184. — P. 2855-2856.

168. Finan T.M., Kunkel B., De Vos G.F., Signer E.R. Second symbiotic megaplasmid in Rhizobium meliloti carrying exopolysaccharide and thiamine synthesis genes//J. Bacteriol. 1986.-V. 167.-N.l.-P. 66-72.

169. Finan T.M., Oresnik I., Bottacin A. Mutants of Rhizobium meliloti defective in succinate metabolism // J. Bacteriol. 1988. — V.170. — P. 3396-3403.

170. Fisher R.F, LongS.R. Rhizobium plant signal exchange // Nature. — 1992. -V. 357.-P. 655-660.

171. Fischer H.M. Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1994. -V. 58. -P. 352-386.

172. Flandung M., Gieffers W. Resistance reactions of leaves and tubers of rolC transgenic tetraploid potato to bacterial and fungal pathogens. Correlation with sugar, starch and clorophyll content // Physiol. Mol. PI. Pathol. 1993. — V. 42. -P. 123-132.

173. Fradkov A. F., Chen Y., Ding L., Barsova E. V., Matz M. V., Lukyanov S. A. Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence // FEBS Lett. 2000. — V. 479. — P. 127-130.

174. Frank B. Ueber die Pilzsymbiose der Leguminosen // Bet. Dtsch Bot. Ges. -1889.-V. 7.-P. 332-346.

175. Fraysse N., Couderc F., Poinsot V. Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis // Eur. J. Biochem. 2003. — V. 270. -P. 1365-1380

176. Freiberg C., Fellay R., Bairoch A., Broughton W.J., Rosenthal A., Perret X. Molecular basis of symbiosis between Rhizobium and legumes // Nature. 1997. -V.387. — P. 394-401

177. Frost L.S., Leplae R., Summers A.O., Toussaint A. Mobile genetic elements: the agents of open source evolution // Nature Rev. Microbiol. 2005. — V. 3. — P. 722-732.

178. Frugier F., Kosuta S., Murray J.D., Crespi M., Szczyglowski K. Cytokinin: secret agent of symbiosis // Trends Plant Sci. 2008. — V. 13. — P. 115-120

179. Fujishige N.A., Lum M.R., de Hoff P.L., Whitelegge J.P., Faull K.F., Hirsch A.M. Rhizobium common nod genes are required for biofilm formation // Mol. Microbiol. 2008. — V. 67. — P. 504-515

180. Gage D.J. Infection and invasion of roots by symbiotic nitrogen-fixing rhizobia during nodulation of temperate legumes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2004.-V. 68.-P. 280-300

181. Galal Y.G.M. Assessment of nitrogen availability to wheat (Triticum aestivum L.) from inorganic and organicNsources as affected by Azospirillum brasilense and Rhizobium leguminosarum inoculation. // Egyptian J.Microbiol. -2003.-V. 38.-P. 57-73.

182. Galibert F., Finan T.M., Long S.R., Puhler A., Abola P. et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti // Science. 2001. — V. 293.-P. 668-672

183. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells // Exp. Cell Res. 1968. V.50. — P. 151-158.

184. Garcia-Fraile P., Rivas R., Willems A., Peix A., Martens M., Martinez-Molina E., Mateos P.F., Velazquez E. Rhizobium cellulosilyticum sp. nov., isolated from sawdust of Populus alba // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. — V. 57. — P. 844848

185. Garrity G.M., Bell J.A., Liburn T. Class I. Alphaproteobacteria class, nov. / In: Bergey’s manual of systematic bacteriology, part C. 2nd edn. (Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., Garrity G.M., Eds.). Springer, New York. 2005. — V. 2.

186. Gaunt M.W., Turner S.L., Rigottier-Gois L., Lloyd-Macgilp S.A., Young J.P.W. Phylogenies of atpD and recA support the small subunit rRNA-basedclassification of rhizobia // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. — V. 51. — P. 2037-2048

187. Geurts R., Fedorova E., Bisseling T. Nod factor signaling genes and their function in the early stages of Rhizobium infection. // Curr Opin Plant Biol. 2005. -V. 8.-P. 346-352

188. Gevers D., Cohan F. M., Lawrence J. G. et al. Re-evaluating prokaryotic species // Nature Rev. Microbiol. 2005. — V. 3. — P. 733-739.

189. Gibson A.H., Child J.J., Pagan J.D., Scowcroft W.R. The induction of nitrogenase activity in Rhizobium by non-legume plant cells // Planta. 1976. — V. 128,-N.3.-P. 233-242.

190. Gibson D.M., Stack S., Krell K., House J. A comparison of soybean agglutinin in cultivars resistant and susceptible to Phytophthora megasperma var. sojae (race 1) // Plant Physiol. 1982. — V. 70. — P. 560-566

191. Gibson K.E., Kobayashi H., Walker G.C. Molecular determinants of a symbiotic chronic infection // Annu Rev Genet. 2008. — V. 42. — P. 413^141

192. Giraud E., Moulin L., Vallenet D., Barbe V., Cytryn E. et al. Legumes symbioses: absence of nod genes in photosynthetic bradyrhizobia // Science. -2007.-V. 316.-P. 1307-1312

193. Giri A., Narasu M.L. Transgenic hairy roots. Recent trends and applications // Biotechnol. Adv. 2000. — V. 18. — P. 1-22.

194. Glagoleva O.B., Kovalskaya N.U., Umarov M.M. Endosymbiosis formation between nitrogen-fixing bacteria Pseudomonas caryophylli and rape root cells // Endosymbiosis Cell Res. 1996. — V. 11.-P. 147-158.

195. Glick B.R. The enhancement of plant growth by free-living bacteria // Can J Microbiol. 1995,-V. 41.-P. 109-117

196. Glick B.R., Penrose D.M., Li J. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth promoting bacteria. // J. Theor. Biol. 1998. — V. 190.-P. 63-68.

197. Glick B.R., Patten C.L., Holguin G., Penrose D.M. Biochemical and Genetic Mechanisms Used by Plant Growth Promoting Bacteria / Imperial College Press, London. 1999. — 267p.

198. Gogarten J.P., Doolittle W.F., Lawrence J.G. Prokaryotic evolution in light of gene transfer. // Mol Biol Evol. 2002. — V. 19, — N. 12. — P. 2226-2238.

199. Gonzalez V., Bustos P., Ramírez-Romero M. A. et al. The mosaic structure of the symbiotic plasmid of Rhizobium etli CFN42 and its relation to other symbiotic genome compartments // Genome Biology. 2003. — V. 4, — N. 6. -R36

200. Gottfert M., Grob P., Hennecke H. Proposed regulatory pathway encoded by the nodV and nodW genes, determinants of host specificity in Bradyrhizobium japonicum. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. — V. 87. — P. 2680-2684

201. Graham D.E. The Isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. — V. 85, N 2. — P. 609613.

202. Graham P.H., Vance C.P. Legumes: importance and constraints to greater utilization. // Plant Physiol. 2003. — V. 131. — P. 872-877

203. Grichko V.P., Glick B.R. Amelioration of flooding stress by ACC deaminase containing plant growth promoting bacteria. // Plant Physiol. Biochem. 2001. -V. 39.-P. 11-17.

204. Gu C.T., Wang E.T., Tian C.F., Han T.X., Chen W.F., Sui X.H., Chen W.X. Rhizobium miluonense sp. nov., a symbiotic bacterium isolated from Lespedeza root nodules.// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. — V. 58. — P. 1364-1368

205. Guan S.H., Chen W.F., Wang E.T., Lu Y.L., Yan X.R., Zhang X.X., Chen W.X. Mesorhizobium caraganae sp. nov., a novel rhizobial species nodulated with Caragana spp. in China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. — V. 58. — P. 26462653.

206. Gusev M.V., Korzhenevskaya T.G., Pyvovarova L.V., Baulina O.I., Butenko R.G. Introduction of a nitrogen-fixing cyanobacterium into tobacco shoot regenerates // Plant. 1986. — V. 167, N. 1. — P. 1-8.

207. Guo X., Flores M., Mavingui P., Fuentes S.I., Hernandez G., Davila G., Palacios R. Natural genomics design in Sinorhizobium meliloti: novel genomic architectures. // Genome Res. 2003. -V. 8. — P. 1810-1817

208. Gyaneshwar P., Hirsch A. M., Moulin L. et al. Legume-Nodulating Betaproteobacteria: Diversity, Host Range and Future Prospects // MPMI. 2020. — V. 24, -N. 11.-P. 1276-1288.

209. Hafeez F.Y., Safdar M.E., Chaudhry A.U., Malik K. A. Rhizobial inoculation improves seedling emergence, nutrient uptake and growth of cotton. // Aust. J. Exp. Agric. 2004. — V. 44. — P. 617-622.

210. Hakkila K., Matsimov M., Karp M., Virta M. Reporter genes lucFF, luxCDABE, gfp, and dsred have different characteristics in whole-cell bacterial sensors. // Anal. Biochem. 2002. — V. 301. — P. 235—242.

211. Hamblin J., Kent S.P. Possible role of phytohemagglutinin in Phaseolus vulgaris L. // Nature New Biol. 1973. — V. 245. — P. 28-29.

212. Hamelryck T.W., Loris R., Bouckaert J., Wyns L. Structural features of the legume lectins // Trends Glycosc. Glycotechnol. 1998. — V. 10. — P. 349-360.

213. Hamill J. D., Lidgett A. J. Hairy root cultures opportunities and key protocols for studies in metabolic engineering / Hairy roots: Culture and Applications. (Doran P., Ed.) Harwood Academic Publishers. Amsterdam, — 1997. -P. 1-30.

214. Han H.S. Lee K.D. Plant growth promoting rhizobacteria effect on antioxidant status, photosynthesis, mineral uptake and growth of lettuce under soil salinity. // Res. J. Agric. Biol. Sci. 2005. — V. 1. — P. 210-215.

215. Han T.X., Wang E.T., Wu L.J., Chen W.F., Gu J.G., Gu C.T., Tian C.F., Chen W.X. Rhizobium multihospitium sp. nov., isolated from multiple legume species native of Xinjiang, China. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. — V. 58. — P. 1693-1699

216. Handelsman J., Stabb E.V. Biocontrol of soilborne plant pathogens. // Plant Cell. 1996.-V. 8.-P. 1855-1869.

217. Hansen J., Jorgensen J.E., Stougaard J., Marcker A.K. Hairy roots a short cut to transgenic root nodules // Plant Cell Rep. — 1989. — V. 8. — P. 12-15.

218. Hara F., de Oliveira L.A. Physiological and ecological characteristics of rhizobio isolated deriving of acid and alic soils of Presidente Figueiredo. // Acta Amazonica. 2004. — V. 34. — P. 343-357.

219. Hara-Nishimura I., Inoue K., Nishimura M. A unique vauolar processing enzyme responsible for conversion several proprotein precursors into the mature forms // FEBS Letters. 1991. — V. 294. — P. 89-93.

220. Hardarson G. Methods for enhancing symbiotic nitrogen fixation // Plant and Soil. 1993,-V. 152.-P. 1-17.

221. Harrison M.J., Dewbre G.R. and Liu J. A Phosphate transporter from Medicago truncatula involved in the acquisition of phosphate released by arbuscular mycorrhizal fungi // Plant Cell. 2002. — V. 14. — P. 2413-2429.

222. Hawes M.C., Brigham L.A., Wen F., Woo H.H., Zhu Y. Function of root border cells in plant health: pioneers in the rhizosphere // Annu Rev Phytopathol. -V. 36.-P. 311-327.

223. Hawley T. S., Telford W. G., Hawley R. G. «Rainbow» reporters for multispectral marking and lineage analysis of hematopoietic stem cells. // Stem Cells. -2001a.-V.19.-P. 118—124.

224. Hawley T. S., Telford W. G., Ramezani A., Hawley R. G. Four-color flow cytometric detection of retrovirally expressed red, yellow, green, and cyan fluorescent proteins. // Biotechniques. 2001b. — V. 30. — P. 1028—1034.

225. Heidstra R., Bisseling T. Nod factor-induced hostresponsesi and mechanisms of Nod factor perception. // New Phytol. 1996. — V. 133. — P. 25^13

226. Heim R., Prasher D. C., Tsien R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994,-V. 91.-P. 12501—12504.

227. Henzi M.X., Christey M.C., McNeil D.L. Factors that influence Agrobacterium r/zzzogewes-mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea L. var. italica) // Plant Cell Rep. 2000. — V. 19. — P. 994-999.

228. Herridge D.F., Peoples M.B., Boddey R.M. Global inputs of biological nitrogen fixation in agricultural systems. // Plant Soil. 2008. — V. 311. — P. 1-18

229. Hirsch P.R, Van Montagu M., Johnston A.W.B., Brewin N.J., Schell, J. Physical identification of bacteriocinogenic, nodulation and other plasmids in strains of Rhizobium leguminosarum // Journal of General Microbiology. 1980. -V. 120.-P. 403-412

230. Hirsch A.M., Brill L.M., Lim P.O., Scambray J., Van Rhijn P. Steps toward defining the role of lectins in nodule development in legumes // Symbiosis. 1995. -V. 19.-P. 155-173.

231. Hirsch P.R. Population dynamics of indigenous and genetically modified rhizobia in the field // New Phytologist. 1996. — V. 133, — N. 1. — P. 159-171.

232. Hirsch A.M., Fang Y., Asad S., Kapulnik Y. The role of phytohormones in plant-microbe symbioses. // Plant Soil. 1997. — V. 194. — P. 171-184.

233. Hirsch A.M. Role of lectins (and rhizobial exopolysaccharides) in legume nodulation // Curr Opin Plant Biol. 1999. — V. 2. — P. 320-326

234. Hoang H.H., Gurich N., Gonzalez J.E. Regulation of motility by the ExpR/Sin quorumsensing system in Sinorhizobium meliloti. // J Bacteriol. 2008. — V. 190. -P. 861-871

235. Hoflich G.,Wiehe W., Kohn G. Plant growth stimulation by inoculation with symbiotic and associative rhizosphere microorganisms. // Experienca. 1994. — V. 50.-P. 897-905.

236. Hong G.F., Burn J.E., Johnston A.W.B. Evidence that DNA involved in the expression of nodulation (nod) genes in Rhizobium binds to the product ofthe regulatory gene nodD. // Nucleic Acids Res. 1987. — V. 15. — P. 9677-9690

237. Horsh R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.C., Fraley R.T. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. 1985. -V. 227.-P. 1229-1231.

238. Hotter G.S., Scott D.B. Exopolysaccharide mutants of Rhizobium loti are fully effective on a determinate nodulating host but are ineffective on an indeterminate nodulating host. // J Bacteriol. 1991. — V. 173. — P. 851-859

239. Hou B. C., Wang E. T., Li Y., et al. Rhizobial Resource Associated with Epidemic Legumes in Tibet // Microb Ecol. 2009a. — V. 57. — P.69-81

240. Hungria M., Stacey G. Molecular signals exchanged between host plants and rhizobia: basic aspects and potential application in agriculture. // Soil Biol Biochem. 1997. — V. 29. — P. 819-830

241. Hynes M.F., McGregor N.F. Two plasmids other than the nodulation plasmid are necessary for formation of nitrogen-fixing nodules by Rhizobium leguminosarum // Mol. Microbiol. 1990a. — V. 4, — N. 4. — P. 567-74.

242. Jackson M. B. Ethylene in root growth and development / In: The Plant Hormone Ethylene. (Matoo A.K., Suttle J. C., Eds.). CRC Press, Boca Raton, FL. USA. 1991.-P. 159-181.,

243. Jefferson R.A. Assaying Chimeric Genes in Plants: The GUS Gene Fusion System // Plant Mol. Biol. Rep. 1987. — V. 5. — P. 387^05.

244. Jensen J.S., Marcker K.A., Otten L., Schell J. Nodule-specific expression of chimaeric soybean leghaemoglobin gene in transgenicLotus corniculatus // Nature- 1986. V. 321.-P. 669-674.

245. Jones K.M., Kobayashi H., Davies B.W., Taga M.E., Walker G.C. How symbionts invade plants: the Sinorhizobium-Medicago model. // Nat Rev Microbiol. 2007. — V. 5. — P. 619-633

246. Jong J.P., Johnston A.W.B. The evolution of specificity in the legume-rhizobium symbiosis // Tree. 1989. — V. 4, — N. 11. — P. 341-349.

247. Jensen E.S., Sorensen L.H. Survival of Rhizobium leguminosarum is soil after addition as inoculant. // FEMS Microbiol Ecol. 1987. — V. 45. — P. 221-226

248. Jordan D.C., Allen O.N. Family I, Rhizobiaceae Conn, 1938 / In: Bergey’s manual of determinative bacteriology, 8th edn. (Buchanan R.E., Gibbons N.E., Eds.). The Williams & Wilkins Co, Baltimore. 1974. — P. 261-264

249. Jordan D.C. Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen. nov., a genus of slow-growing, root nodule bacteria from leguminous plants. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1982. — V. 32. — P. 136-139

250. Jordan D.C. Family III Rhizobiaceae / In: Bergeys manual of systematic bacteriology. (Krieg N.R., Holt J.G., Eds.). Williams and Wilkins Co., Baltimore.- 1984.-V. 1. P. 234-242

251. Jorgensen J.-E., Stougaard J., Marcker A., Marcker K.A. Root nodule specific gene regulation: Analysis of the soybean nodulin N23 gene promoter in heterologous symbiotic systems // Nucl. Acids Res. 1988. — V. 16. — P. 3940.

252. Juhas M., van der Meer J. R., Gaillard M., Harding R. M., Hood D. W., Crook D. W. Genomic islands: tools of bacterial horizontal gene transfer and evolution // FEMS Microbiol. Rev. 2009. — V. 33. — P. 376-393.

253. Jumas-Bilak E., Michaux-Charachon S., Bourg G., Ramuz M., Allardet-Servent A. Unconventional genomic organization in the alpha subgroup of the Proteobacteria. // J Bacteriol. 1998. — V. 180. — P. 2749-2755

254. Karsi A., Menanteau-Ledouble S., Lawrence M.L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring // FEMS Microbiol. Lett. 2006. — V. 260. — P. 216-223.

255. Kennedy I.R., Pereggerk L.L., Wood C. et al. Biological nitrogen fixation in non-leguminous field crops facilitating the evolution of an effective association between Azospirillum and wheat // Plant Soil. 1997. — Vol. 194, N. 1-2. — P. 6579.

256. Kannenberg E.L., Perzl M., Hartner T. The occurrence of hopanoid lipids in Bradyrhizobium bacteria. // FEMS Microbiol Lett. 1995. — V. 127. — P. 255-262

257. Kereszt A., Li D., Indrasumunar A., Nguyen C.D., Nontachaiyapoom S., Kinkema M., Gresshoff P.M. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology // Nat. Protoc. 2007. — V. 2. — P. 948-952.

258. Kijne J.W., Diaz C.L., Pater S. Lectins in the symbiosis between Rhizobia and leguminous plants / In: Adv. Lectin Res. (Franz H., van Driessche E., Kasai K.J., Eds). Berlin: Ullstein Mosby. 1992. — P. 15-50.

259. Kijne J.W., Bauchrowitz M.A., Diaz C.L. Root lectin and Rhizobia II Plant Physiol. 1997. — V. 115. — P. 869-973.

260. Klee H.J., Hayford M.B., Kretzmer K.A., Barry G.F., Kishore G.M. Control of ethylene synthesis by expression of a bacterial enzyme in transgenic tomato plants.//Plant Cell. 1991,-V. 3.-P. 1187-1193.

261. Knosel D.H. Prufung von Bakterien auf Fähigkeit zur Sternbildung // Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg. 1962 — V.116. — P.79-100 (in German).

262. Knosel D.H. Genus IV. Phyllobacterium nom. Rev / In: Bergey’s manual of systematic bacteriology, vol 1 (Krieg N.R., Holt J.G., Eds). The Williams & Wilkins Co., Baltimore. 1984. — P. 254-256

263. Kobayashi H., Naciri-Graven Y., Broughton W.J., Perret X. Flavonoids induce temporal shifts in gene-expression of nod-box controlled loci in Rhizobium sp. NGR234. // Mol Microbiol. 2004. — V. 51. — P. 335-347

264. Konami Y., Yamamoto K., Osawa T., Irimura T. The primary structure of the Cytisus scoparus seed lectin and carbohydrareD binding peptide //J. Biochem. -1992. V. 112, — № 3. — P. 366-375.

265. Kondorosi E., Gyuris J., Schmidt J., John E., Hofmann D.B., Schell J., Kondorosi A. Positive and negative control of nod gene expression in Rhizobium meliloti is reqiured for optimal nodulation. // EMBO J. 1989. — V. 8. — P. 13311340

266. Kondorosi E., Pierre M., Cren M., Haumann U., Buire M., Hoffmann B., Schell J., Kondorosi A. Identification of NolR, a negative transacting factor controlling the nod regulon in Rhizobium meliloti. // J Mol Biol. 1991. — V. 222. -P. 885-896

267. Koonin E. V.,Makarova K. S., Arvind L. Horizontal gene transfer in prokaryotes.Quantification and classification // Annu. Rev. Microbiol. 2001. — V. 55. — P. 709-742.

268. Kosugi S., Ohashf Y., Nakajima K., Arai Y. An Improved Assay for (3-Glucuronidase in Transformed Cells: Methanol Almost Completely Suppresses a Putative Endogenous -Glucuronidase Activity // Plant Sci. 1990. — V. 70. — P. 133-140.

269. Kovach M.E., Elzer P.H., Hill D.S., Robertson G.T., Farris M.A., Roop 2nd R.M., Peterson K.M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying diVerent antibiotic-resistance cassettes // Gene. 1995. — V. 166.-P. 175-176

270. Krol M.J., Kobus J., Fuk B. Wiazanie azotu w parabrodawkach korzeni zboz przez Azospirillum lip. i Acin. like // Zezz. Nauk. Pol. AR Szczecinie. — 1997. -N. 68.-P. 153-161.

271. Krol J., Mazur A., Marczak M., Skorupska A. Syntenic arrangements of the surface polysaccharide biosynthesis genes in Rhizobium leguminosarum. // Genomics. 2007. — V. 89. — P. 237-247

272. Kundig C., Hennecke H., and Gottfert M. Correlated physical and genetic map of the Bradyrhizobium japonicum 110 genome // J. Bacteriol. 1993. — V. 75, -N. 3. — P. 613-622.

273. Kuykendall L.D., Saxena B., Devine T.E., Udell S.E. Genetic diversity in Bradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a proposal for Bradyrhizobium elkanii sp. nov. // Can J Microbiol. 1992. — V. 38. — P. 501-505

274. Y.L., Chen W.F., Han L.L., Wang E.T., Chen W.X. Rhizobium alkalisoli sp. nov., isolated from the legume Caragana intermedia growing in saline-alkaline soils. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009a. — V. 59. — P. 3006-3011

275. Y.L., Chen W.F., Han L.L., Wang E.T., Zhang X.X., Chen W.X., Han S.Z. Mesorhizobium shangrilense sp. nov., isolated from root nodules of Caragana spp. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2009b. V. 59. — P. 3012-3018.

276. Maiden M.C. Multilocus sequence typing of bacteria. // Annu Rev Microbiol. 2006. — V. 60.-P. 561-88

277. Mandaci S., Dobres M. Sequence of a vegetative homolog of the pea seed lectin gene // Plant. Physiol. 1993. — V. 103, — N. 2. — P. 663-664.

278. Marchetti M., Capela D., Glew M. et al. Experimental evolution of a plant pathogen into a legume symbiont // PLoS Biology. 2020. — Vol.8, -N.l. -el000280.

279. Martens M., Delaere M., Coopman R., De Vos P., Gillis M., Willems A. Multilocus sequence analysis of Ensifer and related taxa. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. — V. 57. — P. 489-503

280. Martinez E., Pardo M.A., Palacios R., Cevallos M.A. Reiteration of nitrogen fixation gene sequences and specificity of Rhizobium in nodulation and nitrogen fixation in Phaseolus vulgaris. // J. Gen. Microbiol. 1985. — V. 131. — P. 1779— 1786

281. Martinez-Abarca F., Herrera-Cervera J.A., Bueno P., Sanjuan J., Bisseling T., Olivares J. Involvement of salicylic acid in the establishment of the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiosis. // Mol. Plant Microbe Interact. 1998. — V. 11. — P. 153-155

282. Martinez-Romero E., Segovia L., Mercante F.M., Franco A.A., Graham P., Pardo M.A. Rhizobium tropici: a novel species nodulating Phaseolus vulgaris L. beans and Leucaena sp. trees. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. — V. 41. — P. 417— 426

283. Martinez-Romero E. Coevolution in Rhizobium-legume symbiosis? // DNA Cell Biol. -2009. V. 28. — P. 361-370

284. Martyniuk S., Oron J., Martyniuk M. Diversity and numbers of root-nodule bacteria (rhizobia) in Polish soils. // Acta Soc Bot Polon. 2005. — V. 74. — P. 8386

285. Matz M. V., Fradkov A. F., Labas Y. A., Savitsky A. P., Zaraisky A. G., Markelov M. L., Lukyanov S. A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. // Nat. Biotechnol. 1999. — V. 17. — P. 969—973.

286. Mavingui P., Flores M., Guo X., Davila G., Perret X., Broughton W.J., Palacios R. Dynamics of genome architecture in Rhizobium sp. strain NGR234. // J Bacteriol.-2002.-V. 184.-P. 171-176

287. McCormick D.B. Two interconnected B vitamins: Rhiboflavin and pyridoxine. // Physiol. Rev. 1989. — V. 69. — P. 1170-1198.

288. Mehboob I., Naveed M., Rhizobial Z.A.Z. Association with Non-Legumes: Mechanisms and Applications // Critical Reviews in Plant Science. 2009. — V. 28.-P. 432^56,

289. Menze A., Mollers C. Transformation of different Brassica napus cultivars with three different strains of Agrobacterium rhizogenes II Proc. 10th Int. Rapeseed Congress.- 1999. -P. 15-20.

290. Mercier A., Kay E., Simonet P. Horizontal Gene Transfer by Natural Transformation in Soil Environment // Soil Biology. 2006. — V. 8. — P. 355-373

291. Merzlyak E.M., Goedhart J., Shcherbo D. et al. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime // Nat Methods. 2007. -V. 4.-P. 555-557.

292. Michiels J., Dombrecht B., Vermeiren N., Xi C., Luyten E., Vanderleyden J. Phaseolus vulgaris is a non-selective host for nodulation. // FEMS Microbiol Ecol. 1998.-V. 26.-P. 193-205

293. Miller J.H Experiments in Molecular Genetics / Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. 1972. — 432 p.

294. Mimmack M.L., Hong G.F., Johnston A.W.B. Sequence and regulation of psrA, a gene on the Sym plasmid of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli which inhibits transcription of the psi genes. // Microbiology. 1994. — V. 140. -P. 455-461.

295. Minamisawa K., Ogawa K.I., Fukuhara H., Koga J. Indolepyruvate pathway for indol-3-acetic acid biosynthesis in Bradyrhizobium elkanii. // Plant Cell Physiol. 1996. — V. 37. — P. 449^53.

296. Mirelman D.E., Galun E., Sharon N., Lotan R. Inhibition of fungal growth by wheat germ agglutinin // Nature. 1975. — V. 256. — P. 414-416

297. Mishra R.P.N., Singh R.K., Jaiswal H.K., Kumar V., Maurya S. Rhizobium-mediated induction of phenolics and plant growth promotion in rice (Oryza sativa L.) // Curr. Microbiol. 2006. — V. 52. — P. 383-389.

298. Mitra R.M., Long S.R. Plant and bacterial symbiotic mutants define three transcriptionally distinct stages in the development of the Medicago truncatula/Sinorhizobium meliloti symbiosis. // Plant Physiol. 2004. — V.134. — P. 595-604

299. Moenne-Loccoz Y., Weaver R.W. Involvement of plasmids in saprophytic performance and sodium chloride tolerance of clover rhizobia W14-2 in vitro // Appl. Soil Ecol. 1996. — V. 3, — N. 2. — P. 137-148

300. Moulin L., Munive A., Dreyfus B., Boivin-Masson C. Nodulation of legumes by members of the beta-subclass of proteobacteria. // Nature. 2001. — V. 411. — P. 948-950

301. Moulin L., Bena G., Boivin-Masson C., Stepkowski T. Phylogenetic analyses of symbiotic nodulation genes support vertical and lateral gene co-transfer within the Bradyrhizobium genus. // Mol Phylogenet Evol. 2004. — V. 30. — P. 720-732

302. Muglia C. I., Grasso D. H., Mario Aguilar O. Rhizobium tropici response to acidity involvesactivation of glutathione synthesis // Microbiology. 2007. -V.153, — N4. — P.1286-1296

303. Munoz J.A., Coronado C., Perez-Hormaeche J., Kondorosi A., Ratet P., Palomares A.J. MsPG3, a Medicago sativa polygalacturonase gene expressed during the alfalfa-Rhizobium meliloti interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. -V. 95.-P. 9687-9692.

304. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962. — V. 15. — P. 473^97.

305. Mutch L.A., Young J.P.W. Diversity and specifity of Rhizobium leguminosarum biovar viciae on wild and cultivated legumes. // Mol Ecol. 2004. — V. 13.-P. 2435-2444

306. Nautiyal S.S. Amethod for selection and characterization of rhizospherecompetent bacteria of chickpea. // Curr. Microbiol. 1997. — V. 34. — P. 12-17.

307. Nickoloff J.A. Methods in molecular biology / Humana Press. Totowa, NY. -1995.-V. 47.

308. Nie Y.E., Vesk M., Kennedy I.R., Srickandarajah S., Lane E., Tchan Y.T. Structure of 2,4-D induced 125 paranodules with Rhizobium on wheat // Phytochem. (Life Sci. Adv.). 1992. -N. 11. — P. 67-73.

309. Nie Y.F. Nitrogen fixation in 2,4-D forced associative wheat-diazotroph system // Intern. Workshop Assoc. Interactions Nitrogen-Fix. Bact. Plants (Saratov, June 5-8, 1995): Abstr. Saratov, 1995. P. 32-34.

310. Nilsson O., Olsson O. Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots // Physiol. Plant. 1997. — V. 100.-P. 463-^73.

311. Normander B., Christensen B.B., Molin S., Kroer N. Effect of bacterial distribution and activity on conjugal gene transfer on the phylloplane of the bush bean (Phaseolus vulgaris) // Ibid. 1998. — V. 64, — N. 5. — P. 1902-1909.

312. Oldroyd G.E.D., Downie J.A. Calcium, kinases and nodulation signalling in legumes. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2004. — V. 5. — P. 566-576

313. Oldroyd G.E.D., Downie J.A. Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes // Annu Rev Plant Biol. 2008. — V. 59. — P. 519546

314. Oresnik I.J., Twelker S., Hynes M.F. Cloning and characterization of a Rhizobium leguminosarum gene encoding a bacteriocin with similarities to RTX toxins. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. — V. 65. — P. 2833-2840

315. Otten L., Heifer A. Biological activity of the rolB-like 5′ end of the A4-orfS gene from the Agrobacterium rhizogenes TL-DNA // Mol. Plant-Microbe Interact. -2001.-V. 14.-P. 405-411.

316. Ozkoc I., Deliveli M.H. In vitro inhibition of the mycelial growth of some root rot fungi by Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli isolates. // Turkish J. Biol. 2001. — V. 25. — P. 435-445.

317. Palmer K.M., Young J.P.W. Higher diversity of Rhizobium leguminosarum biovar viciae populations in arable soils than in grass soils. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. — V. 66. — P. 2445-2450

318. Parniske M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses //Nat. Rev. Microbiol. -2008. V. 6, -N. 10. — P. 763-775.

319. Peck M.C., Fisher R.F., Long S.R. Diverse flavonoids stimulate NodDl binding to nod gene promoters in Sinorhizobium meliloti. // J Bacteriol. 2006. -V. 188.-P. 5417-5427

320. Peloquin J. J., Lauzon C. R., Potter S., Miller T. A. Transformed bacterial symbionts reintroduced to and detected in host gut. // Curr. Microbiol. 2002. -V.45.-P. 41—45.

321. Pena H.B., Reyes I. Nitrogen fixing bacteria and phosphate solubilizers isolated in lettuce (Lactuca sativa L.) and evaluated as plant growth promoters. // Intersciencia. 2007. — V. 32. — P. 560-565.

322. Peng G., Yuan Q., Li H., Zhang W., Tan Z. Rhizobium oryzae sp. nov., isolated from the wild rice Oryza alta. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. — V. 58.-P. 2158-2163

323. Perret X., Staehelin C., Broughton W.J. Molecular basis of symbiotic promiscuity. // Microbiol Mol Biol Rev. 2000. — V. 64. — P. 80-201

324. Perrine F.M., Prayito J., Frank J.J., Dazzo B., Rolfe B.G. Rhizobium plasmids are involved in the inhibition or stimulation of rice growth and development. // Aust. J. Plant Physiol. 2001. — V. 28. — P. 923-937.

325. Perrine-Walker F.M., Prayitno J., Rolfe B.G., Weinman J.J., Hocart C.H. Infection process and the interaction of rice roots with rhizobia // J. Exp. Bot. -2007. V. 58. — P. 3343-3350.

326. Petit A., Kühle A., Marcker K.A., Tempe J. Transformation and regeneration of the legume Lotus corniculatus: a system for molecular studies of symbiotic nitrogen fixation // Mol. Gen Genet. 1987. — V. 207. — P. 245-250.

327. Peumans W.J., van Damme E.J.M. Lectins as plant defense proteins // Plant Physiol. 1995. — V. 109. — P. 347-353

328. Peumans W.J., Barre A., Hao Q., Rouge P., van Damme, Els J.M. Higher plants developed structurally different motifs to recognize foreign glycans // Trends Glycosci. Glycotechnol. 2000. — V. 12, N 64. — P. 83-101.

329. Pheler M., Petit M., Martin L., Duhoux E., Tempe J. Transformation and regeneration of a nitrogen-fixing tree, Allocasuarina verticillata II Lam. Biotechnol. 1991. — V. 9.-P. 461-466.

330. Phillips D.A., Joseph C.M., Yang G.-P., Martinez-Romero E., Sanborn J.R., Volpin H. Identification of lumichrome as a Sinorhizobium enhancer of alfalfa root respiration and shoot growth. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1999. — V. 96. — P. 12275-12280.

331. Porter J. R. Host range and implications of plant infection by Agrobacterium rhizogenes II Crit. Rev. Plant. Sei. 1991. — V. 10. — P. 387-421.

332. Prasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W. W., Prendergast F. G., Cormier M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. // Gene. -1992.-V. 111.-P. 229—233.

333. Prell J., Poole P. Metabolic changes of rhizobia in legume nodules. // Trends Microbiol. 2006. — V. 14. — P. 161-168

334. Pueppke S.G., Broughton W.J. Rhizobium sp. strain NGR234 and R. fredii USDA257 share exceptionally broad, nested host ranges. // Mol Plant-Microbe Interact. 1999. — V. 12. — P. 293-318

335. Quan Z.X., Bae H.S., Baek J.H., Chen W.F., Im W.T., Lee S.T. Rhizobium daejeonense sp. nov. isolated from a cyanide treatment bioreactor. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. — V. 55. — P. 2543-2549

336. Quandt H.J., Puehler A., Broer I. Transgenic root nodules of Vicia hirsuta: A fast and efficient system for the study of gene expression in indeterminate-type nodules // Mol. Plant Microbe Interact. 1993. — V. 6, N 6. — P. 699-706.

337. Radeva G., Jurgens G., Niemi M., Nick G., Suominen L., Lindstrom K. Description of two biovars in the Rhizobium galegae species: biovar orientalis and biovar officinalis. // Syst Appl Microbiol. 2001. — V. 24. — P. 192-205

338. Radutoiu S., Madsen L. H., Madsen E. B. et al. Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases // Nature. 2003. — V. 425, — N 6958. — P. 585-592.

339. Redecker D. Molecular identification and phylogeny of arbuscular mycorrhizal fungi // Plant and Soil. 2002. — V. 244. — P. 67-73.

340. Reid M. Ethylene in plant growth, development and senescence / In: Plant Hormones and Their Role in Plant Growth and Development. (Davies P.J., Ed.). Martinus Nijhoff, Den Hague. 1987. — P. 257-279.,

341. Relic B., Talmont F., Korsinska J., Golinowski W., Prome J.-C., Broughton W. J. Biological activity of Rhizobium sp. NGR234 Nod factors on macroptilium atropurpureum. // Mol. Plant-Microbe Interact. 1993. — V. 6. — P. 764-774.

342. Ren D.W., Chen W.F., Sui X.H., Wang E.T., Chen W.X. Rhizobium vignae sp. nov., a symbiotic bacterium isolated from multiple legume species // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020b. — V. 61. — P. 580-586.

343. Ribeiro R.A., Barcellos F.G., Thompson F.L., Hungria M. Multilocus sequence analysis of Brazilian Rhizobium microsymbionts of common bean (Phaseolus vulgaris L.) reveals unexpected taxonomic diversity. // Res Microbiol. -2009.-V. 160.-P. 297-306

344. Rivas R., Martens M., de Lajudie P., Willems A. Multilocus sequence analysis of the genus Bradyrhizobium. // Syst Appl Microbiol. 2009. — V. 32. — P. 101-110

345. Robertson B.K., Dreyfus B., Alexander M. Ecology of stem-nodulating Rhizobium and Azorhizobium in four vegetation zones of Senegal. // Microb Ecol. 1995.-V. 29.-P. 71-81

346. Robleto E.A., Kmiecik K., Oplinger E.S., Nienhuis J., Triplett E.W. Trifolitoxin production increases nodulation competitiveness of Rhizobium etli

347. CE3 under agricultural conditions. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. — V. 64. -P. 2630-2633

348. Roche P., Maillet F., Plazanet C., Debelle F., Ferro M., Truchet G., Prome J.C., Denarie J. The common nodabc genes of Rhizobium meliloti are host-range determinants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. — V. 93. — P. 15305-15310

349. Rodrigues F., van Hemert M., Steensma H. Y., Corte-Real M., Leao C. Red fluorescent protein (DsRed) as a reporter in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacteriol. 2001. — V. 183.-P. 3791—3794.

350. Rodriguez H., Fraga R., Gonzalez T., Bashan Y. Genetics of phosphate solubilization and its potential applications for improving plant growthpromoting bacteria. // Plant Soil. 2006. — V. 287. — P. 15-21.

351. Rogel M.A., Hernandez-Lucas I., Kuykendall L.D., Balkwill D.L., Martinez-Romero E. Nitrogen-fixing nodules with Ensifer adhaerens harboring Rhizobium tropici symbiotic plasmids. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. — V. 67. — P. 3264-3268.

352. Rossbach S., Kulpa D.A., Rossbach U., de Bruijn F.J. Molecular and genetic characterization of the rhizopine catabolism (mocABRC) genes of Rhizobium meliloti L5-30. // Mol Gen Genet. 1994. — V. 245. — P. 11-24

353. Rouge P., Pere D., Bourne Y. In vitro cleavage of the Lathyrus nissolia isolectin//Plant Sci. 1989.-V. 62.-P. 181-189.

354. Rouge P., Risler J. Evidence for the internal sequence homologies in leguminosae lectins: phylogenetical implications // Biochem. Systematics and Ecol. 1990.-V. 18.-P. 29-37.

355. Rudiger H. Purification and properties of blood group specific lectins from Vicia cracca // Eur. J. Biochem. 1977. — V. 72, — N. 2. — P. 317-322.

356. Rudiger H. Plant lectins more than just tools for glycoscientists: occurrence, structure, and possible functions of plant lectins // Acta Anat (Basel). — 1998. — V. 161.-P. 130-52.

357. Safronova V., Chizhevskaya E., Bullitta S., Andronov E., Belimov A., Charles T.C., Lindstrom K. Presence of a novel 16S-23S rRNA gene intergenicspacer insert in Bradyrhizobium canariense strains. // FEMS Microbiol Lett. -2007.-V. 269.-P. 207-212

358. Saha U., Sen M. Nitrogenase activity of diazotrophic strains of Candida tropicalis II Proc. Indian. Acad. Sci. (Plant Sci.). 1990. — V. 100, N 5. — P. 353359

359. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. / Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Cold Spring Lab., 1989.- 1626 p.

360. Sanjuan J., Grob P., Gottfert M., Hennecke H., Stacey G. NodW is essential for full expression of the common nodulation genes in Bradyrhizobium japonicum. // Mol Plant-Microbe Interact. 1994. — V. 7. — P. 364-369

361. Sawada H., Kuykendall L. D., Young J. M. Changing concepts in the systematics of bacterial nitrogen-fixing legume symbionts //J. Gen. Appl. Microbiol. 2003. — V. 49. — P. 155-179.

362. Savka M.A., Liu L., Farrand S.K., Berg R.H., Dawson J.O. Induction of hairy roots or pseudoactinorhizae on Alnus glutinosa, A. acuminata and Elaeagnus angustifolia by Agrobacterium rhizogenes II Acta Ecol. 1992. — V. 13. — P. 423431.

363. Schlaman H.R.M., Horvath B., Vijgenboom E., Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Suppression of nodulation gene expression in bacteroids of Rhizobium leguminosarum biovar viciae.// J Bacteriol. 1991. — V. 173. — P. 4277^1-287

364. Schmidt J., Rohrig H., John M., Wieneke U., Stacey G., Koncz C., Schell J. Alteration of plant growth and development by Rhizobium nodA and nodB genes involved in the synthesis of oligosaccharide signal molecules. // Plant J. 1993. -V. 4.-P. 651-658

365. Scholia M.H., Elkan G.H. Rhizobium fredii sp. nov., a fast-growing species that effectively nodulates soybeans. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. — V. 34. — P. 484-486

366. Schwedock J., Long S.R. Nucleotide sequence and protein products of two new nodulation genes of Rhizobium meliloti, nodP and nodQ. // Mol. Plant-Microbe Interact. 1989. — V. 2. — P. 181-194

367. Scott M.P., Jung R., Muntz K., Nielsen N.C. A protease responsible for post-translational cleavage of a conserved Asn-Gly linkage in glycinin, the major seed storage protein of soybean // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. — V. 89. — P. 685-662.

368. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA / In: Gel electrophoresis of nucleic acids. A practical approach. IRL Press, Oxford. 1982. -P. 3976.

369. Segovia L, Young JP, Martinez-Romero E. Reclassification of American Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli type I strains as Rhizobium etli sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. — V. 43, — N. 2. — P. 374-377.

370. Sekar C., Prasad N.N., Sundaran M.D. Enhancement of polygalacturonase activity during auxing induced paranodulation and endorhizospphere colonization of Azospirillum in rice roots // Indian J. Exp. Biol. 2000. — V. 38, N 1. — P. 8083.

371. Sessitsch A., Hardarson G., de Vos W.M., Wilson K.J. Use of marker genes in competition studies of Rhizobium. // Plant and Soil. 1998. — V. 204. — P. 35-45.

372. Sharma V., Surolia A. Analyses of carbohydrate recognition by legume lectins: size of the combining site loops and their primary specificity // J. Mol. Biol. 1997. — V. 267. -N. 2. — P. 433^145.

373. Sharon N., Lis H. Lectins as cell recognition molecules. // Science. 1989. -V. 246. — P. 227-234

374. Sharon N., Lis H. Legume lectins a large family of homologous proteins // FASEB J. — 1990. — V. 4, — N. 14. — P. 3198-208.

375. Sheikh L.I., Dawar S., Zaki M.J., Ghaffar A. Efficacy of Bacillus thuringensis and Rhizobium meliloti wth nursery fertilizers in the control of root infecting fungi on mung bean and okra plants. // Pak. J. Bot. 2006. — V. 38. — P. 465^73.

376. Shimomura O., Johnson F. H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. II J. Cell. Comp. Physiol. 1962. — V. 59. — P. 223—239.

377. Shoemaker N. B., Wang G. R., Salyers A. A. Multiple gene products and sequences required for excision of the mobilizable integrated Bacteroides element NBU1 // J. Bacteriol. 2000. — V. 182. — P. 928-936

378. Silva C., Kan F.L., Martinez-Romero E. Population genetic structure of Sinorhizobium meliloti and S. medicae isolated from nodules Medicago spp. in Mexico. // FEMS Microbiol Ecol. 2007. — V. 60. — P. 477^189

379. Singh C.D., Dadarwal K.R., Subba Rao N.S. Effectiveness of rhizobia from wild species of Arachis on the cultivated species A. hypogaea and their physiological characteristics // Zblt. Bakt. II. 1976. — V. 131, — N 1. — P. 72-78.

380. Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A. Approved lists of bacterial names. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. — V. 30. — P. 225-420

381. Skorupska A., Janczarek M., Marczak M., Mazur A., Krol J. Rhizobial exopolysaccharides: genetic control and symbiotic functions. // Microb Cell Fact. -2006.-N. 5,-V. 7.-P. 1-19

382. Smith D.L., Prithiviraj B., Zhang F. Rhizobial signals and control of plant growth / In: Nitrogen Fixation: Global Perspectives. (Finan T.M., Brian M.R., Layzell D.B., Vessey K., Newton W.E., Eds.). CABI Publishing, Wallingford, UK. -2002.-P. 327-330.

383. Spaink H.P. Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria. // Annu Rev Microbiol. 2000. — V. 54. — P. 257-288

384. Spaink H.P. Regulation of plant morphogenesid by lipo-chitin oligosaccharides. // Crit. Rev. Plant Sci. 1996. — V. 15. — P. 559-582.

385. Stiller J., Martirani L., Tuppale S., Chian R.-J., Chiurazzi M., Gresshoff P.M. High frequency transformation and regeneration of transgenic plants in the model legume Lotus japonicus II J. Exp. Bot. 1997. — V. 48. — P. 1357-1365.

386. Streit W., Kosh K. Werner D. Nodulation competitiveness of Rhizobium leguminosarum bv phaseoli and Rhizobium tropici strains measured by glucuronidase (gus) gene fusion. // Biol. Fertil. Soil. 1992. — V. 14. — P. 140-144.

387. Stougaard J., Sandal N., Gren A., Kühle A., Marcker K.A. 5′ Analysis of the soybean leghemoglobin lbc3 gene: Regulatory elements required for promoter activity and organ specificity // EMBO J. 1987. — V. 6. — P. 3565-3369.

388. Stubbs M.E., Carver J.P., Dunn R.J. Production of pea lectin in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1986. — V. 261, — N. 14. — P. 6141-6142.

389. Sui X.H., Han L.L., Wang E.T. et al. Novel associations between rhizobial populations and legume species within the genera Lathyrus and Oxytropis grown in the temperate region of China. // Sei China Ser C-Life Sei. 2009. — V. 52, — N.2. -P. 182-192

390. Sullivan J.T, Patrick H.N, Lowther W.L, Scott D.B, Ronson C.W. Nodulating strains of Rhizobium loti arise through chromosomal symbiotic gene transfer in the environment. // Proc Natl Acad Sei U S A. 1995. — V. 92. — P. 8985-8989.

391. Sullivan J., Ronson C. Evolution of rhizobia by acquisition of a 500-kb symbiosis island that integrates into a phe-tRNA gene. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998.-V. 95.-P. 5145-5149

392. Sujatha M.S., Balaji Petety V. Identification of common structural features of binding sites in galactose specific proteins // Proteins. — 2004. — V. 55, — N. 1. — P. 44-65.

393. Svenning M.M., Gudmundsson J., Fagerli I.L., Leinonen P. Competition for nodule occupancy between introduced strains of Rhizobium leguminosarum bv.trifolii and its influence on plant production. // Ann Bot. 2001. — V. 88. — P. 781— 787

394. Tan Z.Y., Kan F.L., Peng G.X., Wang E.T., Reinhold-Hurek B., Chen W.X. Rhizobium yanglingense sp. nov., isolated from arid and semi-arid regions in China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001b. — V. 51. — P. 909-14.

395. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A. V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. «Fluorescent timer»: protein that changes color with time. // Science. 2000. — V. 290. — P. 1585—1588.

396. Timmers A.C., Soupene E., Auriac M.C., de Billy F., Vasse J., Boistard P., Truchet G. Saprophytic intracellular rhizobia in alfalfa nodules. // Mol Plant-Microbe Interact. 2000. — V. 13. — P. 1204-121

397. Thomas C.M., Nielsen K.M. Mechanisms of, and Barriers to, Horizontal Gene Transfer between Bacteria //Nature Rev. Microbiol. 2005. — V. 3. — P. 711-721.

398. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. «Fluorescent timer»: protein that changes color with time. // Science. 2000. — V. 290. — P. 1585—1588.

399. Teyssier C., Marchandin H., Jumas-Bilak E. The genome of alphaproteobacteria: complexity, reduction, diversity and fluidity. // Can. J. Microbiol. 2004. — V. 50. — P. 383-396

400. Treangen T. J., Rocha E. P. C. Horizontal Transjer, Not Duplication, Drives the Expansion of Protein Families in Prokaryotes // PLoS Genetics. 2020. -journal.pgen. 1001284.

401. Trujillo M.E., Willems A., Abril A., Planchuelo A.M., Rivas R., Ludena D., Mateos P.F., Martinez-Molina E., Velazquez E. Nodulation of Lupinus albus by strains of Ochrobactrum lupine sp. nov. //Appl. Environ. Microbiol. 2005. — V. 71.-P. 1318-1327

402. Tsien R. Y. The green fluorescent protein. // Annu. Rev. Biochem. 1998. -V. 67. — P. 509—544.

403. Toledo I., Lloret L., Martinez-Romero E. Sinorhizobium americanus sp. nov., a new Sinorhizobium species nodulating native Acacia spp. in Mexico // Syst. Appl. Microbiol. 2003. — V. 26. — P. 54-64.

404. Tombolini R., Unge A., Davey M.E., de Bruijn F.J., Jansson J.K. Flow cytometric and microscopic analysis of GFP-tagged Pseudomonas fluorescens bacteria // FEMS Microbiol. Ecol. 1997. — V. 22. — P. 17-28.

405. Validation List no. 107. List of new names and new combinations previously effectively, but not validly, published // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. -V.56. -P. 1-6.

406. Van Damme E.J.M., Barre A., Rouge P., Peumans W.J. Cytoplasmic/nuclear plant lectins: a new story. // Trends Plant Sei. 2004. — V. 9. — P. 484^89

407. Van Damme E.J.M., Nausicaa L., Peumans W.J. Plant Lectins. / Eds Kader J.C., Delseny M. Advances in botanical research, 2008. — V. 48. Elsevier Ltd, San Diego, — P. 107-209

408. Vandamme P., Goris J., Chen W.M., de Vos P., Willems A. Burkholderia tuberum sp. nov. and Burkholderia phymatum sp. nov., nodulate the roots of tropical legumes. // Syst Appl Microbiol. 2002. — V. 25. — P. 507-512

409. Vandamme P., Coenye T. Taxonomy of the genus Cupriavidus: a tale of lost and found. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. — V. 54. — P. 2285-2289

410. Velazquez E., Cruz-Sanchez J.M., Mateos P.F., Martinez-Molina E. Analysis of stable lowmolecular weight RNA profiles of members of the family Rhizobiaceae. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. — V. 64. — P. 1555-1559

411. Verkhusha V. V., Akovbian N. A., Efremenko E. N., Varfolomeyev S. D., Vrzhershch P. V. Kinetic analysis of maturation and denaturation of DsRed, a coral-derived red fluorescent protein. // Biochemistry. 2001a. — V. 66. — P. 1342—1351.

412. Verkhusha V. V., Otsuna H., Awasaki T., Oda H., Tsukita S., Ito K. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed fore double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation // J. Biol. Chem. 2001b. -V. 276.-P. 29621-29624.

413. Vilaine F., Casse-Delbart F. Independent induction of transformed roots by the TL and TR regions of the Ri plasmid of agropine type Agrobacterium rhizogenes II Mol. Gen. Genet. 1987. — V. 206. — P. 17-23.

414. Vincent, J. M. A Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria / Oxford: Blackwell Scientific. 1970. 164 p.

415. Viprey V., Rosenthal A., Broughton W.K., Perret X. Genetic snapshots of the Rhizobium species NGR234 genome // Genome Biol. 2000. — V. 1. — P. 1-17

416. Vlassak K.M., Vanderleyden J. Factors influencing nodule occupancy by inoculant rhizobia. // Crit Rev Plant Sci. 1997. — V. 16. — P. 163-229

417. Vulic M.,Dionisio F., Tazddei F., Radman M. Molecular keys to speciation: DNA polymorphismand control of exchange to enterobacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. — V. 94. — P. 9763-9769.

418. Wang E.T., Rogel M.A., Garcia-de los Santos A., Martinez-Romero J., Cevallos M.A., Martinez-Romero E. Rhizobium etli bv. mimosae, a novel biovar isolated from Mimosa affmis.-// Int.-J. Syst, Bacteriol. 1-999^—V.-49,—P. -147-9- -1491

419. Wang F.Q., Wang E.T., Liu J., Chen Q., Sui X.H., Chen W.F., Chen W.X. Mesorhizobium albiziae sp. nov., a novel bacterium that nodulates Albizia kalkora in a subtropical region of China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. — V. 57. — P. 1192-1199.

420. Ward W.W., Prentice H.J., Poth A.F., Cody C.W., Reeves S.C. Spectral perturbations of the Aequorea green-fluorescent protein // Photochem. Photobiol. -1982a. V.35. — P.803—808.

421. Ward W.W., Bokman S.H. Reversible denaturation of Aequorea Green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein // Biochemistry. 1982b. — V.21. — P. 4535—4540.

422. White J., Prell J., James E.K., Poole P. Nutrient sharing between symbionts. // Plant Physiol. 2007. — V. 144. — P. 604-614

423. Webster G., Jain V., Davey M.R., Gouch C., Vasse J., Denarie J., Cocking E.C. The flavonoid naringenin stimulates the intracellular colonization of wheat roots by Azorhizobium caulinodans II Plant Cell Environ. 1998. — V. 21. — P. 373-383.

424. Wei G. H., Zhang Z. X., Chen C., et al. Phenotypic and genetic diversity of rhizobia isolated from nodules of the legume genera Astragalus, Lespedeza and Hedysarum in northwestern China // Microbiological research. 2008. — V.163, -N. 6,-P. 651-662.

425. Werdien D., Peiler G., Ryffel G. U. FLP and Cre recombinase function in Xenopus embryos. // Nucl. Acids Res. 2001. — V. 29. -E53.

426. Wielbo J., Mazur A., Krol J., Marczak M., Kutkowska J., Skorupska A. Complexity of phenotypes and symbiotic behaviour of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii exopolysaccharide mutants. // Arch Microbiol. 2004a. — V. 182. -P. 331-336

427. Wielbo J., Mazur A., Krol J., Marczak M., Skorupska A. Environmental modulation of the pssTNOP gene expression in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. // Can J Microbiol. 2004b. — V. 50. — P. 201-211

428. Wielbo J., Marek-Kozaczuk M., Kubik-Komar A., Skorupska A. Increased metabolic potential of Rhizobium spp. is associated with bacterial competitiveness. // Can J Microbiol. 2007. — V. 53. — P. 957-967

429. Wielbo J., Golus J., Marek-Kozaczuk M., Skorupska A. Symbiosis stage-associated alterations in quorum sensing autoinducer molecules biosynthesis in Sinorhizobium meliloti. // Plant Soil. 2009. — V. 1-2. — P. 399-410

430. Wielbo-J., Marek-Kozaczuk M., Mazur A.T Kubik-Komar A.T Skorupska-A. Genetic and metabolic divergence within a Rhizobium leguminosarum bv. trifolii population recovered from clover nodules. // Appl. Environ. Microbiol. 2020. -V. 76,-N. 14.-P. 4593-4600

431. Willems A., Collins M.D. Phylogenetic analysis of rhizobia and agrobacteria based on 16S rRNA gene sequences. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. — V. 43. — P. 305-313

432. Willems A., Coopman R., Gillis M. Comparison of sequence analysis of 16S-23 S rDNA spacer regions, AFLP analysis and DNA-DNA hibridization in Bradyrhizobium. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2001. V. 51. — P. 623- 632

433. Willems A. The taxonomy of rhizobia: an overview // Plant Soil. 2006. — V. 287.-P. 3-14.

434. Wijffelman C.A., Pees E., Brussel A.A.N. Hooykaas P.J.J. Repression of Small bacteriocin excretion in Rhizobium leguminosarum and Rhizobium trifolii by transmissible plasmids//Мої. Gen. Genet. 1983. -V. 192.-P. 171-176

435. Woese C.R., Stackebrandt E., Weisburg W.G., Paster B.J., Madigan M.T., Fowler V.J., Hahn C.M., Blanz P., Gupta R., Nealson K.H., Fox G.E. The phylogeny of purple bacteria: the alpha subdivision. // Syst Appl Microbiol. -1984.-V. 5.-P. 315-326

436. Wong P. Interactions between Rhizobia and Lentil, Pea, Broad, Bean, and Jackbean. // Plant Physiol. 1980. — V. 65. — P. 1049-1052.

437. WozniakR.A.,-Waldor-M.K. Integrative-and-conjugative elements: mosaic mobile genetic elements enabling dynamic lateral gene flow // Nat Rev Microbiol. 2020. — V. 8. — N. 8. — P. 552-63

438. Xia B., Kawar Z.S., Ju T., Alvarez R.A., Sachdev G.P., Cummings R.D. Versatile Xuorescent derivatization of glycans for glycomic analysis. // Nat Methods. 2005. — V. 2. — P. 845-850

439. Xu L.M., Ge C., Cui Z., Li J., Fan H. Bradyrhizobium liaoningense sp nov, isolated from the root nodules of soybeans // Int. J. Syst. Bact. 1995. — V. 45. — P. 706-707.

440. Xu L., Shi J.F., Zhao P., Chen W.M., Qin W., Tang M., Wei G. H. Rhizobium sphaerophysae sp. nov., a novel species isolated from root nodules of Sphaerophysa salsula in China // Antonie van Leeuwenhoek. 2020. — V. 99. — P. 845-854

441. Yagi K. Chemical determination of flavins // In: Methods of Biochemical Analysis. (Glick, D., Ed.) Interscience Publishers, London, UK.- 1962. -V. 10. -P. 319-356.

442. Yamamoto K., Konami Y., Kusui K. Purification and characterization of a carbohydrate-binding peptide from Bauhinia purpurea lectin // FEBS Letters. -1991.-V. 281.-P. 258-262.

443. Yamamoto K., Konami Y., Osawa T. Alteration of the carbohydrate-binding specificity of the Bauhinia purpurea lectin trough the preparation of a chimeric lectin // J. Biochem. 1992a. — V. 111. — P. 87-90.

444. Yamamoto K., Konami Y., Osawa T. Carbohydrate-binding peptides from several anti-H(O) lectins // J. Biochem. 1992b. — V. 111. — P. 436^139.

445. Yamamoto M., Yoshizaki K., Kishimoto T., Ito H. IL-6 is required for the development of-Th-1 cell-mediated murine colitis // J. Immunol. -=-2000. =■ V—164. -P. 4878^1882.

446. Yan X.R., Chen W.F., Fu J.F., Lu Y.L., Xue C.Y., Sui X.H., Li Y., Wang E.T., Chen W.X. Mesorhizobium spp. are the main microsymbionts of Caragana spp. grown in Liaoning Province of China. // FEMS Microbiol Lett. 2007. — V. 271.-P. 265-273

447. Yanagi M., Yamasato K. Phylogenetic analysis of the family Rhizobiaceae and related bacteria by sequencing of 16S rRNA gene using PCR and DNA sequencer. // FEMS Microbiol Lett. 1993. — V. 107. — P. 115-120

448. Yang S.F., Hoffman N.E. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants. // Annu. Rev. Plant Physiol. 1984. — V. 35. — P. 155-189.

449. Yanni Y.G., Rizk R.Y., Abd El-Fattah F.K., Squartini A., Corich V. et al. The beneficial plant growth-promoting association of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii with rice roots. // Aust. J. Plant Physiol. 2001. — V. 28. — P. 845-870.

450. Yao Z.Y., Kan F.L., Wang E.T., Wei G.H., Chen W.X. Characterization of rhizobia that nodulate legume species of the genus Lespedeza and description of

451. Bradyrhizobium yuanmingense sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. — V. 52. — P. 2219-30.

452. Yoon J.H., Kang S.J., Yi H.S., Oh T.K., Ryu C.M. Rhizobium soli sp. nov., isolated from soil // Int. J. System. Evol. Microbiol. 2020. — V. 60. — P. 13871393

453. Young N.M., Oomen R.P. Analysis of sequence variation among legume lectins: a ring of hypervariable residues forms the perimeter of the carbohydrate-binding site // J. Mol. Biol. 1992. — V. 228. — P. 924-934.

454. Young J.P., Crossman L.C., Johnston A.W., et al. The genome of Rhizobium leguminosarum has recognizable core and accessory components. // Genome Biol. 2006.-V. 7. -R34

455. Young JM. Sinorhizobium versus Ensifer: may a taxonomy subcommittee of the ICSP contradict the Judicial Commission? // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2020. V. 60.-P. 1711-1713

456. Zacharias D.A., Baird G.S., Tsien R.Y. Recent advances in technology for measuring and manipulating cell signals. // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. — V. 10. -P. 416—421.

457. Zahir Z.A., Arshad M., Frankenberger W.T. Jr. Plant growth promoting rhizobacteria: applications and perspectives in agriculture // Adv. Agron. 2004. -V.81.-P. 97-168.

458. Zahran H. H. Rhizobia from wild legumes: diversity, taxonomy, ecology, nitrogen fixation and biotechnology // Journ. Biotechnol. 2001. — V. 91. — P. 143153 » —— . . . . .

459. Zakhia F., de Lajudie P. Modern bacterial taxonomy: techniques review application to bacteria that nodulate leguminous plants (BNL) // Can. J. Microbiol. 2006. — V. 52.-P. 169-181

460. Zehr J.P., Jenkins B.D., Short S.M., Steward G.F. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison. // Environ Microbiol. 2003. — V. 5. — P. 539-554

461. Zeigler D.R. Gene sequences useful for predicting relatedness of whole genomes in bacteria. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. — V. 53. — P. 18931900

462. Zhang X., Sun L., Ma X., Sui X. H., Jiang R. Rhizobium pseudoryzae sp. nov., isolated from the rhizosphere of rice // Int. J. System. Evol. Microbiol. -201 la.-V. 61.-P. 2425-2429

463. Zhang R.J., Hou B.C., Wang E.T., Li Y., Jr, Zhang X.X., Chen W.X. Rhizobium tubonense sp. nov., isolated from root nodules of Oxytropis glabra //1.ternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2020b. — V. 61.-P. 512-7.

464. Zhang J.J., Liu T.Y., Chen W.F., Wang E.T., Sui X.H., Zhang X.X., Li Y., Li Y., Chen W.X. Mesorhizobium muleiense sp. nov., nodulating with Cicer arietinum L. in Xinjiang, China // Int. J. Syst-Evol. Microbiol, -2020. V. 6. Epub ahead of print.

465. Zhao C.T., Wang E.T., Zhang Y.M., Chen W.F., Sui X.H., Chen W.X., Liu H.C., Zhang X.X. Mesorhizobium silamurunense sp. nov., a novel species nodulated with Astragalus species in China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020.- V. 4. Epub ahead of print.

466. Zhaxybayeva O., Lapierre P., Gogarten J. P. Genome mosaicism and organismallineages // Trends Genet. 2004. — V. 20, N 5. — P. 254-260.

467. Zhou PF, Chen WM, Wei GH. Mesorhizobium robiniae sp. nov., isolated from root nodules of Robinia pseudoacacia // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020.- V. 60.-P. 2552-2556.

468. Zurdo-Pineiro J.L., Rivas R., Trujillo M.E., Vizcaino N., Carrasco J.A., Chamber M., Palomares A., Mateos P.F., Martinez-Molina E., Velazquez E.

469. Ochrobactrum cytisi sp. nov., isolated from nodules of Cytisus scoparius in Spain. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. — V. 57. — P. 784-788

470. Zurkowski W., Lorkiewicz Z. Plasmid-mediated control of nodulation in Rhizobium trifolii. // Arch Microbiol. 1979. — V. 123. — P. 195-201

Лучшие брокеры БО с минимальным депозитом и бонусом за регистрацию:
  • Бинариум
    Бинариум

    Лидер на рынке! Надежный брокер бинарных опционов, идеальный для новичков! Даёт большой бонус за регистрацию:

Добавить комментарий
Название: Регистрация сигнальных молекул
Раздел: Рефераты по биологии
Тип: реферат Добавлен 13:45:23 12 июля 2005 Похожие работы
Просмотров: 218 Комментариев: 14 Оценило: 4 человек Средний балл: 5 Оценка: неизвестно Скачать